气溶胶微生物粒子本征荧光计数仪器设计*

贾纹纹，谭 军，张 秦，党 磊，徐 溢，陈 李

（1.重庆大学光电工程学院光电技术与系统教育部重点实验室，重庆 400044；2.重庆大学新型微纳器件与系统技术重点学科实验室，重庆 400044；3.航天神舟生物科技集团有限公司北京市空间生物工程研究中心，北京 100080）

0 引 言

大气溶胶颗粒物带来的影响愈发受到人们重视，当气溶胶中含有细菌、病毒、霉菌孢子以及寄生虫卵等致病微生物时，会给人类健康带来巨大威胁［1，2］。已有论文研究表明，气溶胶中的细菌、真菌能明显增加患肝部、肺部、及过敏性疾病的几率［3］，给人类健康带来了诸多负面影响，因此对其浓度进行实时监测十分必要。

自1968年被报道激光诱导荧光技术以来，科研人员对生物气溶胶的实时监测技术开展了系列研究。2015 年，日本海洋地球科学技术厅Taketani F等人［4］研发了一种气溶胶混合粒子实时监测系统，在环境中成功探测到具有荧光成分的颗粒；2018年，中国科学院上海光学精密机械研究所对生物气溶胶监测进行了系列研究，实现了生物气溶胶实时检测装置［5］；2020 年，Jeong Y S等人［3］采用紫外发光二极管诱导荧光，研制了手持式生物气溶胶实时监测系统，通过测量荧光和散射光强度，确定目标生物粒子。上述研究的基本思路类似，但对微生物本征荧光特性研究较少。

本文在光路整形设计研究基础上［6］，对微生物含有的荧光活性物质及几种典型细菌的激发和发射光谱进行了测试，进一步对仪器的气路、光检测结构进行优化设计，完成仪器系统的设计和搭建，并完成对仪器性能的初步测试。

1 粒子计数原理分析

1.1 光散射粒子检测原理

粒子对光的散射可以分为瑞利散射和米氏（Mie）散射两种。如图1所示，当粒子直径远小于入射光波长λ时，表现为瑞利散射，前向和后向散射光分布比较对称；当粒子直径与入射光波长λ相当时，表现为Mie散射，此时前向散射光更强，方向性比较明显［7］，随着粒子粒径进一步增大，前向散射光会更强。

由于气溶胶生物粒子直径通常在0.5 μm以上，与激发光波长相比主要表现为Mie 散射［8］。散射模型如图2 所示，若散射角为θ，则沿着散射角θ方向的散射光强度表达式如式（1）［9］所示

图2 均匀球形粒子的光散射

式中s1（θ），s2（θ）为关于粒子粒径d的函数，由此可推导出散射光强度I（θ）与粒径d及散射角θ有关［10］。当散射角度固定时，即可通过探测散射光的强度，实现对不同粒径的粒子进行分类计数。

1.2 微生物粒子本征荧光特性分析

绝大部分微生物粒子含有色氨酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD＋）、核黄素等荧光活性分子［11，12］。如图3所示，当这些活性分子受到特定波长入射光照射时，部分处于基态的电子吸收光子能量跃迁至高能级的激发态，并发生振动弛豫而以热能形式消耗掉一部分能量后，处于激发态的最低振动能级；再跃迁回基态能级，并辐射出荧光。这个过程中由于热能消耗，导致辐射光子能量低于吸收的光子能量（ΔV′＜ΔV），即荧光发射波长大于入射波长。而大部分非生物粒子，则不具有荧光发射特性。

采用瓦里安Cary Eclipse分子荧光光谱仪，对荧光活性物色氨酸、NAD＋和核黄素进行了测试，结果如图4所示。

处于3种荧光物质激发波长范围的激光器典型波长有280，355，405 nm等。其中，280 nm的光源可对Tryptophan激发，355，405 nm 可对NAD＋和黄素腺嘌呤二核苷酸（flavinadenine dinucleotide，FAD）激发。280，355 nm连续输出的小体积紫外激光器功率较低（10～20 mW）；而405 nm 的连续输出的小体积紫外激光器功率可达100 mW 以上，对提高仪器的灵敏度十分有利。选取较为常见的微生物进行荧光光谱测试实验，测试结果如图5 所示。可见几种微生物的荧光谱峰范围非常接近，峰值位置约为485 nm。

图5 微生物荧光光谱

2 微生物粒子计数仪器设计

2.1 装置整体结构设计

微生物粒子计数装置如图6 所示。激发光出射后，经整形得到均匀的光束并进入检测腔［6］；检测腔主要由激光输入通道、光陷阱、气溶胶输入输出通道和凹面反射镜组成，粒子与光束相互作用产生荧光和散射光，由检测腔下方凹面反射镜收集；再通过二向色镜，将荧光信号分离，然后采用光电倍增管对两路光信号进行探测。信号处理电路完成探测器输出电信号的模／数（A／D）转换、数据缓存、峰值鉴别及分类计数功能，最后将结果上传至上位机进行显示。

图6 计数仪整体结构示意

2.2 气路结构设计

气流裹挟待测粒子进入装置内光检测区，完成粒子检测。若气路设计不合理，则检测腔区域内容易产生湍流现象，导致气流裹挟的粒子出现漏检及重复检测的问题。因此对进气、出气通道进行了优化，当进气口相距6 mm、内径为3 mm时结果最优，仿真结果如图7（a）所示。从仿真结果可以看出，气流的发散程度较小，湍流强度较弱。对进入腔体内的粒子进行轨迹追踪，结果如图7（b）所示，只有极少部分粒子产生偏移。统计数据如表1 所示，粒子的偏移率不超过3.2%，处于较低的水平。

表1 粒子轨迹分布统计数据

图7 气路结构仿真结果

2.3 光探测结构设计

检测腔内气流与激光束垂直交叉，交点处即为光检测核心区，产生的荧光与散射光通过光学元件进行收集。通常对光信号的收集分为前向和侧向2 种方式，前向收集方式将聚焦透镜放置在散射光前向，透镜前设置光陷阱，消除入射光对散射收集的影响；侧向收集方式将球面反射镜结构装配于光路气路交叉平面的90°侧向，通过球面反射对光信号进行会聚收集。

为选择一种更好的收集方式，采用定量方法对上述2种方式在0.5 ～5.0 μm范围内粒子的散射光收集量进行积分计算，计算模型如图8所示，对不同粒径粒子在同一位置进行相同收集面积的积分运算。侧向收集选用球形模型，而前向收集方式采用聚焦透镜，因此可近似于矩形模型。

图8 2 种收集方式仿真

由于此处并不是对实际收集的光通量进行计算，因此对比考察2种方式相对收集量的变化趋势，将其绘制成曲线如图9所示。通过仿真结果可以看出，随着粒子粒径的不断增大，前向和侧向收集方式的散射光收集量均出现增加，但前向收集方式增加趋势较为缓慢，侧向收集方式增加趋势更迅速，侧向收集方式具有更好的线性。除此之外，前向收集方式收集装置与入射光同轴，因此散射光的收集极易受入射光影响产生误差。而侧向收集方式收集装置位于入射轴正交方向，有效避免了入射光的干扰，因此检测腔设计中选用侧向光收集结构更为合理。

图9 相对收集量变化趋势

3 性能测试与分析

组装完成的仪器装置如图10所示。

图10 微生物粒子计数装置

对气溶胶样本进行采样，图11 为荧光通道和散射光通道的检测信号，通过设计的算法对脉冲信号进行统计，即可获得不同粒子的数量。将其中较为明显的特征信号进行分析，图12（a）为一个普通尘埃粒子经过检测区时，散射光通道产生了一个光脉冲信号，而荧光通道无信号；图12（b）为一个微生物粒子通过检测区时，散射光通道和荧光通道均产生一个光脉冲。测试结果证明，本文检测装置可以完成微生物粒子的检测，并实现微生物粒子与普通尘埃粒子的区分。

图11 荧光和散射光检测信号

图12 单个粒子检测信号

4 结 论

本文通过对色氨酸、NAD ＋、核黄素等荧光活性分子的光谱测试，获得了激发波长和荧光发射波长，选定了405 nm的激发光。通过对金黄色葡萄球菌等微生物粒子的光谱测试，进一步证实了405 nm激发光可以有效地激发微生物粒子的荧光信号。对仪器整体结构、光学检测腔等进行了设计，完成了检测装置的构建。初步测试结果表明，该装置可以实现对空气中各种粒子的散射光信号和微生物粒子的荧光信号探测。下一步将对该装置进行标定，为进一步研制气溶胶微生物粒子浓度监测仪器奠定基础。