新型BC佐剂系统的研究进展

江秋虹，陶立峰 综述，王国治，赵爱华 审校

1.安徽智飞龙科马生物制药有限公司，安徽 合肥 230088；2.中国食品药品检定研究院，北京 102629

新型佐剂以及新型佐剂疫苗逐渐成为疫苗研究领域的新热点。美国食品药品监督管理局（the Food and Drug Administration，FDA）将佐剂分为3 类：①增强抗原向抗原呈递细胞和／或淋巴结的传递，从而改善免疫反应，如铝盐和油包水乳剂，如诺华公司的MF59、葛兰素史克公司（GSK）的AS03系统以及其他脂质体；②免疫刺激剂或免疫增强剂，主要通过受体介导的信号通路来调节免疫反应的质量，如单磷酸脂质（monophosphoryl lipid，MPL）、QS21、CpG、细胞因子等；③由①和②组合而成，称为佐剂系统（adjuvant system），如GSK的AS04和AS01［1］。

目前采用新佐剂的人乳头状瘤病毒（human papillomavirus，HPV）疫苗、乙肝疫苗和带状疱疹疫苗等均已通过临床研究证实具有较大突破，如HPV疫苗和乙肝疫苗采用AS04（因其中的组分MPL 可诱导更高水平的体液免疫反应和Th1 型细胞免疫反应）已经上市［2］；疱疹病毒疫苗采用AS01，因脂质体加入QS-21 和MPL 免疫增强剂后可明显使机体产生高效价抗体并增强细胞免疫反应，已在美国和欧洲上市销售［3-4］。美国Novavax 的新冠疫苗应用自己开发的Matrix-M 佐剂，采用新配方增强了佐剂效果，且耐受性良好，分别被《欧盟委员会》和英国批准有条件上市许可［5-6］；此外，国外还有多种新型佐剂（系统）产品已在开展临床试验，而中国目前为止除铝佐剂广泛应用于疫苗研发生产，鲜有其他新型佐剂成功上市。

综上可以看出，佐剂对提高基因工程类疫苗的免疫原性具有重要作用，开发能够大规模生产且效果好的佐剂对于基因工程类疫苗意义重大。疫苗的竞争实际上是佐剂的竞争。

目前国内外对于含有CpG 基序的寡核苷酸（CpG-ODN）佐剂疫苗报道较多，该佐剂能诱导天然免疫和获得性免疫，与细菌类或病毒类疫苗联用可诱导较高的抗体水平和较强的T 辅助细胞（Th）1 类细胞免疫应答［7-11］。CpG-ODN 来源有两种：一种是人工合成的未甲基化CpG ODN，因其片段小，在体内易降解，为增加其在体内稳定性，一般均进行全部硫代磷酸化修饰，这种非天然碱基的加入，不但增加了合成成本，也增加了对机体作用的复杂性；第二种是原核生物，如细菌基因组DNA。前者具有代表性的CpG 1018 作为佐剂的乙肝疫苗HEPLISAV-B 在美国批准上市［12］，但一度由于其安全性，经过3 次临床试验，最终才因其优势的疗效予以批准，但FDA专家仍提示上市后监测应特别关注其在心血管方面的副作用和安全问题［13］。

天然大分子核酸配以无机盐与缓冲体系构成BC 佐剂系统，其中天然大分子核酸是拥有自主独立知识产权的BCG-CpG-DNA 生物佐剂，是从卡介菌（BCG）中提取的富含CpG基序DNA纯度极高的单一DNA，与已上市的约10 亿人次临床使用的BCG 多糖核酸（商品名：斯奇康）中的核酸为同一物质；采用该佐剂系统的冻干重组结核病疫苗已完成Ⅰ期临床试验，重组带状疱疹疫苗（CHO 细胞）正在新药临床试验申请（investigational new drug，IND）阶段，已有的研究结果均显示安全有效［14-15］。以上研究证明该佐剂用于人体是安全的。本文对该佐剂的来源、发展历史以及生物学活性和免疫机制的研究进展、安全性评价等作一综述。

1 BC佐剂来源及其发展历史

1.1 BCG-CpG-DNA佐剂来源及其生物学特性 BCGCpG-DNA 佐剂是从目前约5亿人次在临床上使用的BCG中提取的，具有免疫刺激活性、不同大小（3 000 ～10 000 bp）、不同序列的双链DNA片段混合物。免疫刺激的有效成分为含有的非甲基化的胞苷磷酸鸟苷核心及其特定的侧翼序列（CpG 基序），其结构特征为5'-嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶-3'，CpG 有效含量为20% ～30%，该含量与全基因组DNA 中的CpG 含量基本一致。即该佐剂BCG-CpG-DNA 片段基本保留了BCG 全基因组DNA 中全部的CpG 基序［16］。基于以上特性，由于提取的DNA 片段含有大量未甲基化CpG基序，因此将其命名为BCG-CpG-DNA。

1.2 BC佐剂系统的发展历史

1984年，日本TOKU-NAGA 等［17］发现，从BCG 中提纯的核酸（MY-I）能刺激机体免疫反应，开启了细菌DNA 免疫刺激性的研究。1995 年，KRIEG 等［18］证实，细菌DNA 中非甲基化的CpG 基序才是细菌DNA免疫刺激作用的关键。为模拟细菌DNA 的免疫刺激作用，合成的CpG ODN 被广泛用在实验中［19］。但人工合成的CpG ODN制备成本较高。

2004年，本课题组采用机械破碎、溴化十六烷基三甲基胺（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）沉淀、酚∶氯仿∶异戊醇抽提法，从BCG 中制备BCGCpG-DNA，经化学方法确定其理化成分［20］。首次制备一种来源于细菌提取物、并证实该佐剂本身具有免疫活性、与疫苗中抗原在体内作用能诱导Th1 型为主的免疫应答的CpG-DNA 免疫佐剂，为第一代佐剂。考虑到第一代佐剂采用化学法提取，应用于生产存在安全风险，因此对制备工艺进行改进，获得精制CpG-DNA，此为第二代佐剂；鉴于复合佐剂在发挥疫苗的免疫效用方面越来越显著的协同佐剂优势，开展BCG-CpG-DNA 与铝盐和缓冲体系联用构成CpG复合佐剂（BC02）与细菌类及病毒类抗原配伍制备疫苗的安全性及有效性研究，结果显示，免疫保护效果显著增强且安全性良好，此为第三代佐剂。

1.2.1 第1代佐剂 为单一BCG-CpG-DNA佐剂（BC01，指代单一BCG-CpG-DNA，取BCG-CpG-DNA 前两个英文字母首字母，并与复合佐剂相区分），BCG培养后菌体经机械破碎、高速冷冻离心、收集上清，CTAB 沉淀、氯化钠溶液溶解，酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提，70%乙醇洗涤，溶于TE缓冲液（Tris-Cl pH 8.0）中经透析、除菌、过滤获得。通过核酸含量测定，确定BC01 佐剂的核酸总含量；通过CpG 有效含量测定，确定BC01 佐剂核酸中有效组分含量；通过核酸分子量测定，确定BC01 佐剂分子量范围。大量研究证实，该新型富含CpG 基序佐剂本身具有免疫活性，作为佐剂诱导的是Th1 型为主的免疫反应，机体产生抗体类型以IgG2a 为主，对细菌类抗原、病毒性抗原、寄生虫类抗原均有显著的佐剂作用，既能诱导细胞免疫反应，也能诱导体液免疫反应，提高疫苗的保护效果，可作为治疗及预防用疫苗佐剂，且初步确定用于疫苗佐剂的BCG-CpG-DNA 含量为每单位剂量疫苗中10 ～250 µg／人份，该含量与抗原及疫苗种类相关，且与铝佐剂有协同作用。该佐剂已获得国家发明专利（200410033878.1）［20-25］。

1.2.2 第2代佐剂 为单一BCG-CpG-DNA佐剂（BC01），因第一代佐剂制备过程中使用有机溶剂酚、氯仿去除多糖、蛋白等杂质，酚、氯仿均为有毒试剂，在制药生产中使用具有潜在危险。如果用于生产，不但有安全隐患，产品中残留量需进行检测，也增加了质量控制检测项目。第二代佐剂对第一代佐剂制备工艺进行了改进，采用离子交换层析纯化的方法，从BCG菌体裂解液中直接将多糖、蛋白和RNA 等杂质去除，经离子交换层析置换缓冲液、超滤浓缩后，获得高浓度、高纯度的BCG菌体DNA（BCG-CpG-DNA），无有机溶剂残留，该方法尤其适合产业化生产需要。该佐剂已获得国家发明专利（201310586057.X）［26］。

1.2.3 第3 代佐剂 为BC01 佐剂与铝盐和缓冲体系联用构成CpG 复合佐剂BC02（BCG CpG DNA combination adjuvant system 02）。

研究表明，复合佐剂可在最大程度上增强疫苗免疫应答，上调对机体的全面保护，已成为佐剂研究的一个重要方向，在研制中具有巨大优势［27］。走在前沿的主要为GSK公司的佐剂系统（adjuvant systems），包括AS01 ～AS04 等。除已用于上市制品的AS04、AS01，AS02（MPL 与QS21 水包油系统）用于疟疾疫苗及结核病疫苗并已进入临床试验，AS01 用于结核病疫苗M72：AS01二期临床试验已获得较好成果，在结核分枝杆菌潜伏感染的HIV 阴性成人体内接种后的3 年内，降低肺结核发病率的总效力约为50%，有望在结核病防控中发挥重要作用［8，27-30］。

研究表明，CpG DNA分别与铝盐、MF59、脂质体、poly I：C联用，广泛应用于细菌类及病毒类疫苗临床及临床前研究中。GSK 拟将CpG DNA 与MPL、QS21、脂质体（liposomes）联用，应用于肿瘤疫苗的研究中；另有CpG DNA 与宿主防御性多肽和聚磷腈构建的复合佐剂模型，联合多种疫苗抗原在动物和人类疫苗的广泛试验中均获得稳定和高效的免疫效果［7-11］。

本课题组采用BC01 佐剂配以铝盐与缓冲体系构成的CpG复合佐剂（BC02）配伍细菌类抗原和病毒类抗原开展药效学评价，已完成的研究结果显示，采用BC02 佐剂的冻干重组结核病疫苗（AEC／BC02）可诱导细胞免疫反应，对结核分枝杆菌潜伏感染豚鼠具有预防保护效果，临床前安全性评价良好。2015年，新型结核病疫苗是国内唯一获得国家药品监督管理局颁发的人体临床试验批件（批件号：2015L-00704）的疫苗［22，29，31］。采用BC02佐剂的重组带状疱疹疫苗免疫原性评价研究结果显示，该佐剂与铝佐剂协同作用，可提高IFNγ、IL-2 分泌水平；促进抗gE蛋白特异性抗体及亚型，尤其是Th1 型IgG2a 的产生；提高水痘病毒（疫苗株）特异性抗体水平，促进产生抗野毒株的抗体，诱导水痘病毒（疫苗株）和野毒株特异性中和抗体产生［15］。目前该项目正在申报IND阶段中。

由于BCG-CpG-DNA 佐剂作用的广谱性，未来也可与更多其他佐剂联合使用作为细菌类或病毒类疫苗的佐剂，推动该佐剂向更深代次的研究，在未来疫苗开发中具有更广阔的应用前景。

2 BC佐剂系统生物学活性研究进展

将BCG-CpG-DNA 单独或联合Al（OH）3配伍不同细菌类、病毒类及寄生虫类抗原，评价其对不同疫苗的免疫佐剂作用。

2.1 对重组结核分枝杆菌抗原Ag85b 的作用 将重组结核分枝杆菌Ag85b 分别与铝佐剂、BCG-CpGDNA 或铝佐剂+ BCG-CpG-DNA 免疫小鼠，同时设PBS、BCG 对照组，评价INFγ分泌水平及对潜伏感染结核分枝杆菌H37Rv豚鼠的疫苗保护力。结果表明，BCG-CpG-DNA 对重组结核分枝杆菌Ag85b 有佐剂作用，表现在该佐剂能提高抗原特异性IFNγ 分泌水平，与铝佐剂联用，能提高感染动物保护效力，表现为已感染的动物经疫苗治疗后，脏器病变阴转率提高，动物脏器病变指数降低，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）［21］。

2.2 对重组HBsAg的作用 将HBsAg单独或分别联合铝佐剂、BCG-CpG-DNA 或铝佐剂+ BCG-CpGDNA 免疫小鼠，检测特异性抗-HBs 中和抗体水平、抗-HBs IgG 亚型、细胞毒T 淋巴细胞功能、分泌IL-4水平。结果表明，BCG-CpG-DNA 对重组HBsAg 具有较好的免疫佐剂作用，能提高抗-HBs中和抗体水平，促进抗原特异性IgG2a 产生，诱导Th1 型免疫应答，与铝佐剂协同作用能部分逆转Th2 反应，同时能增强抗原特异性CD8+T淋巴细胞的杀伤作用［20］。

2.3 对A群脑膜炎球菌多糖疫苗的作用 将BCG-CpGDNA 与流脑多糖疫苗共同免疫小鼠3 次，评价其对小鼠IgG、IgG1 和IgG2a 抗体水平变化的影响。结果表明，BCG-CpG-DNA 对A 群脑膜炎球菌多糖疫苗具有免疫佐剂作用，可提高A 群脑膜炎球菌多糖疫苗特异性IgG 抗体水平，并能促进特异性抗体亚类的产生［20］。

2.4 对H1N1 流感疫苗的佐剂作用 用H1N1 流感疫苗单独或联合BCG-CpG-DNA 免疫小鼠，同时设PBS 对照组，检测血凝抑制（haemagglutination inhibition，HI）抗体及抗体亚类。结果表明，BCG-CpGDNA 对H1N1 流感疫苗具有佐剂作用，可促进抗体提前产生，缩短动物血清阳转时间，HI抗体水平提高2 ～3 倍，对抗原特异性IgG1 水平影响不大，但能显著性提高IgG2a水平［20］。

2.5 对狂犬病疫苗的佐剂作用 用狂犬病疫苗单独或联合BCG-CpG-DNA、单独BCG-CpG-DNA 分别免疫小鼠各2 次，于第7 ～14、28、42 天经眼眶采血，快速免疫荧光灶抑制试验（rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）检测血清抗体效价，酶联免疫斑点技术（enzyme linked immunospot assay，ELISPOT）检测脾淋巴细胞经狂犬病病毒抗原刺激后分泌的IFNγ及IL-2 水平。结果表明，BCG-CpG-DNA 对狂犬病疫苗有佐剂作用，从初次免疫第7天开始至第42天，狂犬病疫苗联合BCG-CpG-DNA 组血清中和抗体效价及IFNγ、IL-2水平均高于纯病毒抗原组，并高于纯病毒抗原组与纯佐剂组之和；第14 天时，上述两组小鼠血清抗体效价均达峰值，且差异最大。证实佐剂的加入可刺激机体产生更强的体液免疫，并产生持续的高水平细胞免疫应答［23］。

2.6 对弓形虫STAg 疫苗的佐剂作用 将STAg 单独或分别与BCG-CpG-DNA、Al（OH）3、Al（OH）3+BCGCpG-DNA 免疫小鼠，设生理盐水对照组，抗体水平、抗体效价及特异性INFγ 淋巴细胞数量检测结果表明，STAg 联合BCG-CpG-DNA 和铝盐能诱导小鼠产生更强的体液免疫和细胞免疫，铝盐与BCG-CpGDNA佐剂联用对弓形虫STAg具有免疫协同效应［24］。

2.7 对新冠DNA 疫苗的佐剂作用 将pSV10-SARSCoV-2单独或联合BC01佐剂、单独BC01佐剂免疫小鼠，设PBS对照组，ELISA法检测血清抗体结合滴度、疫苗对当前流行假病毒D614G、D614G + I472V、L452R 和V483A产生的突变体的中和能力，ELISPOT检测IFNγ 和IL-2 细胞免疫反应。结果表明，BC01佐剂可促进小鼠中和抗体的早期产生，促进DNA 疫苗中和全部假病毒变异体，增加了IFNγ 和IL-2 斑点细胞数量。采用BC01 佐剂DNA 疫苗组合物可用于预防和／或治疗冠状病毒感染和／或由感染引起的疾病［25］。

综上所述，BCG-CpG-DNA 对不同细菌类、病毒类、寄生虫类抗原均具有免疫佐剂作用，既能诱导细胞免疫，也能诱导体液免疫，免疫反应类型以Th1 型为主。可明显增强抗原特异性抗体IgG水平，显著提高IgG2a水平。BCG-CpG-DNA 佐剂与铝佐剂协同作用，可明显逆转单独铝佐剂疫苗诱导的Th2 反应并向Th1转化。与新冠DNA 疫苗联用诱导了更高滴度的中和抗体和更广范围的假病毒突变体，这在全球新冠大规模流行及新的病毒突变株不断出现的今天，更具有现实意义。

3 BC佐剂系统免疫机制的研究进展

BC佐剂系统通过以下免疫机制发挥佐剂作用。

3.1 刺激固有免疫 LI 等［16］研究发现，BC 佐剂中的BCG-CpG-DNA 本身在信号通路水平上调核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路、促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路中关键蛋白分子的磷酸化水平；在转录水平促进肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）转录；在细胞因子分泌水平促进TNF-α 和MCP-1、IFNγ、IL-6及IL-17 等细胞因子分泌；在细胞功能水平促进抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APC）增殖，上调MHC-Ⅱ分子和其他共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达、促进吞噬抗原能力。其对固有免疫刺激作用主要依赖于TLR-9 受体存在，是有效的TLR-9 受体激动剂。BC 佐剂中的铝佐剂与BCG-CpG-DNA 有协同刺激作用［32］。

3.2 提高免疫应答速度、延长免疫反应持续时间 LI等［15］研究发现，BC 佐剂与抗原配伍后，初次免疫后7 d即能诱导细胞免疫反应，末次免疫后24周仍维持一定水平细胞免疫、体液免疫与免疫记忆能力，与抗原对照组相比差异有统计学意义（P＜0.000 1）。

3.3 增强细胞介导的免疫反应 LI 等［15］和ZHOU等［25］研究发现，BC 佐剂与抗原配伍后，能显著提升分泌抗原特异性IFNγ与IL-2的T细胞数量。

3.4 增强体液介导的免疫反应、调节抗体亚类与活性 研究发现，BC 佐剂与抗原配伍后，能显著提升IgG 滴度，提高IgG2a／IgG1 比例［15］，增强抗体中和活性［15，25］。

3.5 促进免疫记忆 LI 等［15］研究发现，BC 佐剂与抗原配伍后，能显著提升记忆T细胞与B细胞数量。

4 BC佐剂系统非临床安全性评价

该项评价参考文献［33］，以小鼠、大鼠、豚鼠、Beagle 犬等动物为研究对象，采用肌肉注射、腹腔注射、静脉注射等多种方式，进行了一般药理学研究、急性毒性试验、长期毒性试验、肌肉刺激试验、溶血试验、全身主动过敏试验、微生物回复突变（Ames）试验、小鼠骨髓微核试验、染色体畸变试验、胚胎-胎仔发育毒性试验、生育力与早期胚胎发育毒性试验等，上述研究委托浙江省医学科学院安全性评价研究中心完成。

4.1 一般药理学研究 采用不同动物种属（小鼠、犬）肌肉注射方式，BCG-CpG-DNA 复合佐剂系统（BC02）7 500、3 750、1 875 µg／kg 剂量对小鼠精神神经系统无明显影响；犬心血管及呼吸系统试验中，300 µg／kg 剂量对犬仅有R 波幅度升高的影响。BCG-CpG-DNA 复合佐剂系统对小鼠的无毒副反应出现剂量大于7 500 µg／kg，犬显示毒性的剂量为300µg／kg，无毒副反应出现剂量为150µg／kg。

4.2 急性毒性试验 采用不同动物种属（小鼠、大鼠、豚鼠）单次肌肉注射方式，BCG-CpG-DNA 复合佐剂系统（BC02）150 µg／kg 剂量未见异常反应，未见动物死亡，未显示靶器官（靶组织）中毒，体质量随试验时间延长而增加。小鼠、大鼠两种动物模型组织病理学检查结果显示，给药组动物的给药局部有白色或土黄色小结节，触摸较硬；其余脏器未见异常病理变化。镜下可见给药组动物均出现给药部位受试物沉积并形成异物肉芽肿样结节，分析是给予的受试物在局部蓄积、沉积后，机体刺激性反应导致。

4.3 长期毒性试验 采用8次重复肌肉注射方式，BCGCpG-DNA复合佐剂系统（BC02）500、100和20µg／kg剂量对Beagle 犬一般行为、体质量、体温、摄食、血液学、生化学、心电、尿液、眼科、脏器重量和系数未见明显影响，免疫原性上引起Beagle 犬的体液免疫应答［抗药物抗体（anti-drug antibody，ADA）的生成］，病理剖检大体观察和病理组织检查发现给药部位及给药部位淋巴结与剂量相关的受试物沉积（停药后检查），500 和100µg／kg 剂量组犬给药部位及其淋巴结出现剂量相关的受试物沉积和单核细胞增生，恢复期结束后虽略有减轻但仍存在，给药部位由于受试物沉积而出现异物肉芽肿样结节；20µg／kg 剂量组给药部位出现受试物沉积和单核细胞增生，淋巴结髓质出现反应性增生。二期检查各剂量组犬肠系膜淋巴结、给药部位肌纤维和其他脏器均未见明显异常。在试验剂量条件下，Beagle 犬肌肉注射给予BCG-CpG-DNA 复合佐剂系统（BC02）主要毒性靶器官是给药部位及给药部位淋巴结，无毒副反应剂量低于20µg／kg。

4.4 肌肉刺激试验 采用单次肌肉注射方式，在150µg／次剂量条件下，BCG-CpG-DNA 复合佐剂系统（BC02）对兔股四头肌无刺激反应。

4.5 溶血试验 按常规动物溶血试验方法，BCGCpG-DNA复合佐剂系统（BC02）无溶血和凝集作用。

4.6 全身主动过敏试验 采用3 次肌肉注射致敏和1 次静脉注射激发方式，BCG-CpG-DNA 复合佐剂系统（BC02）对豚鼠在致敏和激发期间，高低剂量（37.5µg、7.5µg）组均未见异常反应；其首次致敏、末次致敏和激发时的平均体质量与相应时间的0.9% NaCl 注射液阴性对照组相似（P＞0.05）。表明BC02高低剂量对豚鼠无过敏反应。

4.7 遗传毒性试验 采用平板掺入法，BCG-CpG-DNA复合佐剂系统（BC02）的微生物回复突变（Ames）试验结果为阴性；采用单次肌肉注射方式，BC02 对小鼠骨髓嗜多染红细胞未见诱发微核的作用；采用中国仓鼠肺细胞株（CHL）为靶细胞，有丝分裂中期染色体为检测对象，BC02 对中国仓鼠肺成纤维细胞的染色体畸变诱发作用为阴性。

4.8 生殖毒性试验 将雌、雄SD 大鼠于合笼前分别2 和5 次肌肉注射BCG-CpG-DNA 复合佐剂系统（BC02）750、150 和30 µg／（kg·次）后，按1∶1 比例合笼，BC02 对大鼠无明显的亲代一般毒性；对雌雄大鼠的生殖机能及生育力无明显毒性；对大鼠胚胎形成及早期胚胎发育未见明显影响；可诱导大鼠产生体液免疫应答，产生抗药物抗体，但未形成循环免疫复合物；无毒副反应剂量≤750µg／（kg·次）。

将雌鼠合笼前及孕后共3 次肌肉注射750、150、30µg／kg BCG-CpG-DNA 复合佐剂系统（BC02），未见明显母体毒性、胚胎-胎仔发育毒性及致畸作用；可诱导大鼠产生体液免疫应答及抗药物抗体，并在少数高剂量组大鼠体内形成循环免疫复合物；无毒副反应剂量≤750µg／（kg·次）。

综上所述，BCG-CpG-DNA 复合佐剂系统（BC02）非临床安全性评价结果表明，该复合佐剂系统是安全的，为临床研究提供了参考。

5 BC佐剂系统临床安全性评价

BCG-CpG-DNA 佐剂原液已用于冻干重组结核病疫苗（AEC／BC02）（ClinicalTrials.gov登记号：NCT-03026972）。2018 年9 月在上海市公共卫生临床中心完成该疫苗的Ⅰa 期临床研究。Ⅰa 期选择25 名结核分枝杆菌未感染人群［TB-PPD 皮试和Quanti-FERON-TBGold（QFT）检测均阴性，简称PPD-QFT-］作为受试者，包括安慰剂组5 名、低剂量佐剂组10名、低剂量疫苗组10 名。采用臀部肌肉注射方式，初步评价了6 剂次（每剂间隔2 周）试验疫苗的安全性和耐受性。结果表明，试验疫苗在结核分枝杆菌未感染人群中安全性和耐受性良好，可继续开展下一步临床试验。Ⅰb 期临床研究于2020 年5 月在武汉市传染病医院启动，旨在通过结核病疫苗不同接种部位（上臂三角肌注射途径）的接种方式，评价疫苗安全性和耐受性。截止目前，已完成所有受试者全程免疫后6 个月的安全性观察等现场工作，未发生1 例严重不良事件，不良反应以Ⅰ级和Ⅱ级为主，主要为注射部位疼痛，无Ⅲ级及以上不良反应发生，临床试验安全性结果显示疫苗安全性良好［29，31］。

6 总结及展望

新型佐剂的使用可能引发疫苗学的一场新革命［34］。理想的佐剂对免疫系统有广泛影响，既可有效激活体液和细胞免疫，又可在普通人群中使用仍具有良好的安全性和耐受性。正在研发的佐剂有上百种，但受限于安全性和有效性等因素，已上市预防性疫苗佐剂仅8 种，而我国目前疫苗使用佐剂为传统铝佐剂，大多数佐剂被国外制药公司（如GSK 等）控制，需获得许可方可在临床上使用。因此，应大力推动国内优良候选佐剂进入临床研究。

新型BC 佐剂系统中BC01 非甲基化CpG 基序决定了其作用不具有种属差异性，最大程度地保留了免疫刺激成分，工艺可控，可节约生产成本，适与其他佐剂构成佐剂系统发挥强大免疫刺激作用，并可同时诱导机体形成Th1和Th2型免疫应答，几乎对所有蛋白质抗原和灭活疫苗均具有佐剂作用，在与其他佐剂合用时还可弥补其他佐剂诱导Th2 型免疫应答的缺陷。此外，一些不能与Al（OH）3胶佐剂混合的减毒活疫苗或多价疫苗中，BC01 可作为佐剂单独使用，甚至与新冠DNA 疫苗联用在提高中和抗体滴度和对抗病毒突变株上，具有独特潜力。另外，BC01佐剂还可刺激机体产生较早、较持久的免疫应答，在免疫原性较弱和免疫原数量较少时尤为重要，为上述方面的研究提供了全新选择。复合佐剂BC02 组成成分的Al（OH）3无机盐佐剂与BC01 生物佐剂在激活机体固有免疫应答上具有协同加强作用。与常用CpG 相比，最大区别是其为微生物来源的大分子量天然CpG DNA，而常用CpG为人工合成小分子ODN。BCG-CpG-DNA 结构为双链DNA，常用CpG 为单链DNA，两者免疫刺激的有效成分均为未甲基化CpG基序，在免疫刺激性上均为CpG 与TLR-9 受体结合而刺激免疫反应，作用基本一致。BC01 佐剂除制备优势外，最大优势在于安全性和人体使用剂量，BCGCpG-DNA 佐剂每人用剂量约100µg，远低于已上市乙肝疫苗Heplisav-B 中采用的CpG 1018（3 mg）［12-13］和正在进行Ⅱ／Ⅲ期临床的新冠疫苗（SCB-2019）（三叶草生物制药有限公司）中采用的CpG 1018（1.5 mg）［9，35］。在当前全球疫苗分配不公、可及性问题日渐突出前提下，BC 佐剂系统在疫苗研发产品产业化进程中具有独特优势。

BC佐剂系统为一种新型免疫佐剂系统，由于BCGCpG-DNA本身具有免疫刺激作用，特别是对细胞免疫和抗体反应的增强作用，其作为疫苗佐剂具有有效性、安全性及通用性，且质量可控，并已获得2 项专利授权［20-26］，可促进疫苗的量产、可及性和可负担性，为其应用于重大传染病新疫苗的开发奠定了基础。

但BCG-CpG-DNA 佐剂系采用机械破碎方式从BCG中提取DNA，因此BCG-CpG-DNA佐剂是随机断裂成的大小为3 000 ～10 000 bp 的DNA 片段，虽采用核酸含量、分子量、CpG 有效含量测定作为不同批次BCG-CpG-DNA 佐剂一致性的评价指标，但仍需开展充分的结构确证及质量控制，以确定不同批次间佐剂质量的一致性。

随着对BC 佐剂系统免疫佐剂活性和质控研究的不断深入，其独特的优势会越来越受到医用生物制品研发者的重视，应用前景将更加广阔，可能会从根本上解决佐剂这一疫苗行业国内存在短板的问题。