基于结合纳米技术的细菌用于肿瘤诊疗的研究进展

薛鑫 综述，张英英，王汉杰 审校

1.天津大学生命科学学院，天津 300072；2.徐州医科大学医学影像学院，江苏 徐州 221004

近年，基于肿瘤微环境（tumor microenvironments，TMEs）已设计出大量细菌介导的肿瘤诊疗剂，为肿瘤的诊疗提供了安全有效的手段。由于TMEs 坏死的肿瘤核心富营养化、实体肿瘤缺氧微环境、肿瘤细胞外pH 较低等原因，许多兼性或专性厌氧菌，如鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）、大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）、单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、新生梭菌（Clostridium novyi）及双歧杆菌（Bifidobacterium）等，均具有显著的肿瘤靶向和杀伤能力［1-7］。因此，该类细菌可作为一种新型递送载体，通过运输细胞因子、免疫调节剂、细胞毒性药物、前药转化酶、治疗肽／蛋白质或siRNA、多模态成像剂等进行肿瘤靶向诊疗［8］。合成生物学技术的发展与进步，有效提高了工程菌构建的安全性、靶向性和可控性［9-11］。

合成生物学技术与纳米技术的有效结合大幅扩展了后者的应用范畴。纳米技术可满足肿瘤诊疗和预防等多样化的要求，在药物递送过程中具有独特的优势，如可增加难溶药物的溶解度、促进药物的溶酶体逃逸、避免网状内皮系统的吞噬清除并可控制药物的时空释放等［12］。随着纳米技术的快速发展，其与工程菌的有机结合可有效促进治疗药物、成像分子的高效输送，更好地抑制肿瘤的发生与发展，如用于动物肿瘤诊疗的结合纳米技术的细菌是在细菌表面附着纳米颗粒，通过尾静脉注射后到达TMEs，对肿瘤进行有效诊疗。本文就近年结合纳米技术的细菌用于肿瘤诊疗的研究进展及其面临的挑战和可能的解决方案作一综述，以期为推动肿瘤诊疗研究的快速发展提供参考。

1 结合纳米技术的细菌在肿瘤诊疗中的应用

根据细菌与纳米技术的结合方式，可将其分为3类：细菌表面纳米工程、细菌内纳米工程及基于细菌的仿生纳米颗粒。

1.1 细菌表面纳米工程 细菌的运动性及其对外部信号的响应能力可用于设计构建细菌微／纳米机器人［13］，其具有较高的载药率、良好的生物相容性、可降解性和临床转化潜力。细菌表面也可作为纳米药物的递送平台，实现纳米药物进入肿瘤组织、TMEs积累及定点释放等。细菌微／纳米机器人能够在体内外接收外界或内部信号，如光、热、磁、超声波与细菌群感信号等［14-16］，实现肿瘤诊疗的智能与可控。

1.1.1 可视化递送 ZHANG 等［17］将表达抗人表皮生长因子受体2（anti-human epidermal growth factor receptor 2，anti-HER2）的细菌与磁性纳米粒子结合，通过磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）观察该系统靶向过表达HER2 肿瘤的过程。XING 等［14］将负载吲哚菁绿（indocyanine green，ICG）的纳米颗粒共价吸附在趋磁细菌AMB-1 表面，构建具有光激活和磁操纵双重特性的微型细菌机器人。在磁场操纵下，微型细菌机器人显示出一致的迁移轨迹，在肿瘤部位呈现增强的荧光信号，为细菌微／纳米机器人可视化靶向递送提供了方法。HARIMOTO 等［18］利用合成生物学技术开发了一种基因编码的微生物封装系统，通过调节其表面的荚膜多糖表达，为细菌穿上一层“隐身衣”，协助细菌逃避免疫系统，提高治疗性细菌递送效率，再通过荧光成像（fluorescence imaging，FI）手段实现靶向肿瘤可视化的过程。

1.1.2 高效肿瘤治疗

1.1.2.1 化学治疗 化学治疗是一种传统的治疗方式，但其药物毒副作用给患者带来了沉重的身体负担。EKTATE 等［15］将负载阿霉素（doxorubicin，DOX)的低温敏感脂质体附着在减毒沙门菌（Salmonella）表面，用于结肠癌的化疗，当药物递送至肿瘤部位时，利用高强度聚焦超声和40～42 ℃的热疗释放DOX。SONG等［19］将负载DOX 和索拉非尼（sorafenib，SOR）的脱氧胆酸（deoxycholic acid，DA）修饰在凝结芽孢杆菌的孢子（Bacillus coagulanspores）表面，纳米载体可有效保护药物通过胃部，在肠道部位，孢子-DA制剂可穿透肠上皮细胞，增加基底侧药物释放，表面崩解的疏水蛋白涂层和亲水性DA 自组装形成纳米载体，用于结肠癌治疗。

1.1.2.2 光热治疗 厌氧菌与功能性纳米载体结合可有效改善缺氧肿瘤的治疗效果。LUO 等［20］设计了两种策略，一是将短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）与纳米颗粒结合，靶向输送至肿瘤中；二是先注射梭状芽胞杆菌孢子（Clostridiumspores），再注射梭状芽孢杆菌单克隆抗体修饰的纳米颗粒，与梭状芽胞杆菌孢子进行靶向结合，纳米颗粒由上转换纳米棒（upconversion nanorods，UCNRs）和金纳米棒（aunanorods，AuNRs）组成，可用于肿瘤的CT 成像和光热消融，结果表明，以抗体为导向的第二种策略可提供更强的成像效果和更长的滞留期，有效消除肿瘤。WANG等［21］将大肠埃希菌MG1655设计为一种热响应细菌，生物矿化的AuNPs 在激光照射下产热，用于光热治疗的同时诱导溶细胞素A 表达，该系统具有良好的肿瘤消融能力。

1.1.2.3 光动力治疗 WU等［22］将AIE纳米颗粒（AIE photosensitizer nanoparticles，TDNP）、聚乙基亚胺（polyethylenimine，PEI）与E.coli构成生物混合系统TDNP，该系统在光照条件下不仅可增加E.coli中蛋白质的释放，还可产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），杀死肿瘤细胞。DENG 等［16］在工程E.coli的表面修饰光敏剂二氢卟吩e6（chlorin e6，Ce6），利用Ce6 介导的荧光成像实现肿瘤的靶向诊断，E.coli在肿瘤部位表达H2O2酶，催化H2O2生成O2，缓解了TMEs 缺氧问题，从而提高了光动力治疗效果。

1.1.2.4 化学动力治疗 ZHANG 等［23］报道，金和铂复合物修饰的E.coli（Bac-Au@Pt）在酸性条件下可催化释放ROS。体内成像结果表明，该纳米酶系统大量聚集在肿瘤区域，还可刺激T细胞释放IFNγ，特异性降低肿瘤细胞内的抗氧化性。

1.1.2.5 基因治疗 HU 等［24］在工程细菌表面修饰阳离子聚合物负载质粒DNA 纳米颗粒，促进质粒DNA 从吞噬小体中逃逸，从而有效递送编码血管内皮生长因子受体2的DNA 疫苗，用于肿瘤免疫治疗，小鼠正电子发射断层成像（positronemission tomography，PET）技术检测结果显示，肿瘤体积明显减小，表明工程细菌表面的阳离子聚合物具有良好的质子酸缓冲作用，提高了细菌在胃部的耐酸能力。

1.1.2.6 免疫治疗 NACIUTE 等［25］将含肿瘤抗原和佐剂的脂质体附着在E.coli表面，显著提高了小鼠骨髓源性树突状细胞表面CD80、CD40 和CD86 蛋白的表达。WEI 等［26］将免疫佐剂雷西莫特（Resiquimod，R848）负载在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（polylacticco-glycolic acid，PLGA）中制备PLGA-R848，通过静电作用连接至MG1655表面，Toll样受体7／8激动剂R848 和E.coli可显著促进M2 巨噬细胞极化为M1 巨噬细胞。

1.1.2.7 联合治疗 LIU 等［27］将载有ICG 的人血清白蛋白纳米颗粒（HSA／ICG）通过酰胺键附着在Synechococcus7942表面，Synechococcus7942在660 nm激光照射下产生O2，可显著改善肿瘤缺氧，促进产生更多的ROS，从而诱导肿瘤细胞死亡，并可促进产生IL-10 和IFNγ，有效逆转肿瘤免疫抑制微环境。CHEN等［7］在SalmonellaVNP20009表面修饰聚多巴胺纳米颗粒，在肿瘤部位用近红外激光照射，并联合局部注射负载抗程序性细胞死亡-1 肽AUNP-12 凝胶，可在晚期黑色素瘤小鼠模型中表现出较强的抗肿瘤效果。WANG 等［28］在表达黑色素的工程E.coli表面附着抗程序性死亡蛋白1抗体（anti-programmed death-1 antibodies，αPD-1）的免疫检查点抑制剂，在NIR光照下，黑色素可产生温和而均匀的热，与局部抑制剂结合，从而发挥双重免疫激活效应。

1.1.2.8 细菌代谢物治疗 CHEN 等［29］利用希瓦菌（S.oneidensis，SO）将电子转移至金属矿物质的能力，在SO表面修饰二氧化锰（MnO2）纳米花，构建乳酸燃料生物杂交体。通过细菌的缺氧趋化作用，将MnO2纳米花递送至肿瘤中，与肿瘤代谢物乳酸分别作为电子受体和电子供体，促进乳酸在肿瘤细胞间隙的持续分解代谢，减少肿瘤外乳酸含量，限制了肿瘤利用乳酸抑制产生IFNγ等细胞因子，增强T细胞和NK细胞的免疫监视。WANG 等［30］将装载DOX 的MOF纳米颗粒及透明质酸与SO 结合，构建了一种自驱动生物反应器，通过SO 介导的肿瘤内乳酸消耗、电子从SO 转移至MDH、Fe3+还原诱导MDH 分解、药物控制释放和H2O2介导的Fe2+至Fe3+再转化的系列过程，实现肿瘤特异性杀伤。

功能细菌不仅能分解肿瘤生长所需原料，如乳酸、氨基酸来抑制肿瘤生长［30-31］，也能利用代谢物（如NO3-）制备大量抗肿瘤药物。ZHENG等［32］将氮化碳（C3N4）整合至E.coli表面，C3N4在光照射下生成的电子转移至表达硝酸盐或亚硝酸盐还原酶的E.coli中，促进内源性NO3-代谢为细胞毒性NO，从而促进肿瘤细胞凋亡。细菌表面纳米工程有效改善了靶向性、安全性和有效性，但也存在一些不足，如纳米材料完全包裹细菌外膜时，细菌趋化能力会受到影响，靶向肿瘤能力被削弱；纳米材料与细菌之间需要更强的结合方式，如酰胺键，可有效防止纳米材料的提前脱落［33］；另外，细菌不会立即被清除，可能在器官中积累，诱发慢性炎性反应或其他有害影响［34］。

1.2 细菌内纳米工程 细菌内纳米工程包括合成金属纳米颗粒和蛋白质纳米颗粒。许多金属纳米颗粒是通过化学合成方法开发的，有毒溶剂和试剂的加入导致金属纳米颗粒的生物相容性差。另外，金属纳米颗粒的尺寸、形状和形态重现性均较低［35］。因此，细菌内纳米工程合成金属纳米颗粒的研究越来越受到关注。细菌绿色生物制造蛋白质纳米颗粒表现出更好的生物安全性，越来越多的蛋白质纳米颗粒应用于肿瘤诊疗研究。

1.2.1 细菌内合成金属纳米颗粒 近年，细菌内合成的大多数金属纳米颗粒的抗肿瘤活性已得到证实，为肿瘤治疗领域带来新的活力。ALMALKI 等［36］用芽孢杆菌KFU36（Bacillus spKFU36）合成15～40 nm的银纳米颗粒（silver nanoparticles，AgNPs），从肿瘤血管腔穿过内皮进入TMEs 并积累，可显著诱导肿瘤细胞凋亡。YANG 等［37］发现生物合成的AgNPs 可增强细胞内ROS生成，增加脂质过氧化，有效改善甲状腺癌化疗效果。VAIRAVEL等［38］利用肠球菌（Enterococcus sp）合成金纳米颗粒（gold nanoparticles，AuNPs），在细胞间产生ROS 抑制肿瘤细胞，也可导致肿瘤细胞线粒体损伤，从而引起细胞凋亡。RAJKUMAR等［39］利用恶臭假单胞菌合成硒纳米颗粒，可在低浓度下杀死肿瘤细胞。

磁小体是由趋磁细菌合成的生物相容性磁性纳米颗粒，主要由铁和铁的氧化物组成。在特定条件下，具有高矫顽力和高热容的磁小体在较高温度下表现出较好的磁性能，可显著提高热效率。有研究将磁小体注射至小鼠胶质母细胞瘤中，暴露在几种交变磁场中可产生较强的热效应，使肿瘤消失，无明显副作用［40］。

E.coli可合成不同类型的金属纳米颗粒，如Cd-SeZn、PrGd、CdCs、FeCo、Au 和AgNPs［41］。通过调节金属离子的浓度控制合成金属纳米颗粒的大小。利用细菌合成金属纳米颗粒不仅具有治疗效果，还可作为药物输送载体，拓宽了细菌疗法的临床应用。

1.2.2 细菌内合成蛋白质纳米颗粒 细菌不仅可合成金属纳米颗粒，也可合成蛋白质纳米颗粒，这是一种更安全、结构更稳定的药物,主要包括成像剂与抗原递送载体，如气泡、铁蛋白笼、封装体、小热休克蛋白和细菌微组分等［42-46］。有研究利用能编码合成气泡的细菌实现在体肿瘤的超声成像（ultrasound imaging，UI），并利用低频超声空化引起的机械效应治疗肿瘤［42］。HAN 等［47］开发了一种以细菌微组分为载体，含有肿瘤模拟抗原鸡卵清蛋白（ovalbummin，OVA）的蛋白质纳米疫苗，工程细菌微胶囊在体内通过产生裂解基因回路，释放该蛋白质纳米疫苗，可激活小鼠的特异性免疫以预防肿瘤，通过表达近红外荧光蛋白（infrared fluorescent protein，iRFP）实现细菌体内荧光成像，该系统具有持久释放蛋白质纳米疫苗的潜力，是一种有前途的长效原位药物设计策略。

1.3 基于细菌的仿生纳米颗粒 仿生纳米颗粒是指从天然细菌中提取的生物活性成分，包括细菌膜、细菌囊泡和其他活性物质，具有良好的生物相容性、独特的靶向特性和抗肿瘤能力。近年，细菌仿生纳米颗粒是装载化疗和免疫治疗药物的有效载体，其本身也是一种强大的免疫佐剂，可有效激活机体免疫。

1.3.1 细菌生物膜 WANG 等［48］利用罗伊乳酸杆菌生物膜（Lactobacillus reuteribiofilms，LRM）包裹高锰酸锌-介孔二氧化硅纳米颗粒（ZGGO@SiO2@LRM），能够耐受胃部强酸环境，实现5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）在结直肠癌中的释放。KUMERIA 等［49］从澳大利亚Murray河细菌的生物膜废物中提取氧化铁纳米线（bacteria iron oxide nanowires，Bac-FeOxNWs），并负载DOX，用于体外肿瘤光热治疗。负载DOX的Bac-FeOxNWs孵育乳腺癌细胞，暴露在交变磁场10 min后，细胞活力降低36%。YI等［50］采用铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中提取的鼠李糖脂组装成纳米粒子，并载有光敏剂脱镁叶绿素a（pheophorbide a，Pba），通过近红外荧光成像技术观察纳米颗粒的分布，结果表明，在小鼠鳞状细胞癌细胞7（mouse squamous cell carcinoma 7，SCC7荷瘤小鼠中，该纳米离子具有良好的抑瘤作用。因此，细菌生物膜在肿瘤治疗中具有较大的应用潜力。

1.3.2 细菌菌蜕（bacterial ghosts，BG） 革兰阴性菌裂解产生的空细胞膜BG 具有一些独特的优势，如BG 可诱导有效的免疫反应来抑制肿瘤细胞增殖，且能够减少化疗药物的使用剂量，从而降低对健康组织的损害［51］。RABEA等［52］利用Salmonella细菌BG作为疫苗，免疫大鼠后，血清中检测到较高水平的IgG。

1.3.3 外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMV） 与BG 相似，OMV 是革兰阴性菌在生长过程中脱落的外膜。OMV 携带许多免疫刺激物，可在体内诱导产生适当的免疫反应，并与负载药物的纳米颗粒发挥协同作用［53］。CHEN 等［54］报道，OMV 包覆的聚合物纳米颗粒不仅发挥化疗作用，直接杀死肿瘤细胞，还能刺激机体产生强烈免疫反应，显著抑制肿瘤生长。CHENG 等［55］利用合成生物学技术开发出“即插即用”型工程菌OMV 肿瘤疫苗平台，可快速展示肿瘤抗原并实现高效递送和免疫刺激。该平台有望满足复杂多变的肿瘤抗原的临床需求，推动肿瘤疫苗发展。

1.3.4 微细胞（minicells） 细菌微细胞也是一种有应用前景的递送载体［56］。微细胞为纳米级大小、无核，能够进行转录和翻译。有研究通过敲除minCD基因，提高E.coliNissle1917（EcN）中minE的表达，可促进产生更多的微细胞，通过在微细胞表面插入低pH 多肽，靶向酸性TMEs，并进行生物荧光成像，利用肿瘤靶向的微细胞负载DOX，可使原位乳腺癌显著消退，且无严重不良反应［57］，表明细菌微细胞可有效降低纳米药物对体内正常组织的毒副作用。目前，装载紫杉醇的Salmonella微细胞已在Ⅰ期临床试验中获得成功，观察期间无患者死于不良事件［58］。

1.3.5 其他活性物质 ZHENG等［59］采用仿生策略将来自多种细菌不同结构的佐剂活性成分融为一体，以发挥协同的免疫刺激作用，将Salmonella脂多糖减毒成分单磷酰脂质A 和分枝杆菌（Mycobacteria）胞壁酰二肽的类似物米伐木肽嵌入脂质体磷脂双分子层中，模拟细菌细胞壁；脂质体表面连接重组表达的Salmonella鞭毛蛋白，模拟细菌鞭毛；脂质体包载含有非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸序列的DNA 纳米颗粒，模拟细菌拟核，制备得到细菌仿生肿瘤疫苗佐剂。通过荧光成像观察，发现该佐剂可转运至淋巴结，能通过多条信号通路激活免疫系统，对小鼠黑色素瘤的治疗和预防效果显著优于弗氏佐剂。该免疫佐剂与光热治疗相结合可作为光热治疗肿瘤疫苗。

基于细菌的肿瘤诊疗纳米工程汇总见表1。

2 临床转化中的机遇与挑战

细菌与纳米技术结合可有效提高肿瘤诊疗效果，在基础科学研究中取得了较好的成果。将其用于临床治疗仍有一些问题需要解决，如增强递送过程的可视化是首要条件，不仅可检测肿瘤转移情况，也可监测细菌在体内实时繁殖情况。增强细菌靶向肿瘤的能力是另一个挑战，这将使诊疗制剂更加安全，易于获得监管部门的批准。目前，已有相关细菌制剂进入临床试验，均显示出良好的安全性，但治疗效果不显著。因此，提高治疗效果也是一个亟待解决的问题。

2.1 可视化递送 递送过程的实时监测对促进结合纳米技术的细菌的临床应用具有重要意义。目前，有研究已开发了多种方法来识别肿瘤内的细菌，如生物发光、荧光、MRI、PET 和UI［14，17，24，42，60］。由于可见光在组织中的穿透率较低，且存在背景信号干扰，光学成像技术在临床应用中仍具有挑战性。UCNPs具有发光稳定、发射峰窄、荧光寿命长的特点［61］，其介导的时间分辨成像技术可有效消除背景信号干扰，提高肿瘤诊断的准确性［62-63］。另外，MRI 和PET技术具有更好的灵敏度和穿透深度，在增强可视化递送方面具有良好的应用前景。趋磁细菌合成磁小体或直接修饰磁纳米颗粒赋予了细菌MRI成像的能力［64］。基于18F-脱氧溶糖醇和代谢2-硝基咪唑为基础的PET 成像能够实现E.coli在肿瘤部位定植的可视化［65］。

2.2 提高靶向性 为实现更安全有效的细菌疗法，需要开发具有更强肿瘤靶向能力的细菌。专性厌氧菌利用乏氧靶向的特性，可特异性靶向肿瘤组织，而不扩散至健康组织。同时，可通过基因工程提高兼性厌氧菌的靶向能力，以减少其对健康组织的侵袭［20］，如通过合成生物学技术将乏氧启动子构建至“专性”厌氧Salmonella typhimurium菌株YB1 和ST4基因组中，使其只能定植于肿瘤组织坏死区域，从而提高菌株靶向能力及安全性［10］。而早期转移性肿瘤区域是部分含氧的，专性厌氧菌无法进入。因此，为提高细菌疗法的诊疗效率，依据细菌的多重趋向性，即趋化性、趋磁性和趋酸性，来实现肿瘤的靶向治疗［66-69］。如由Fe3O4纳米颗粒修饰的天然铂螺旋藻可用于肿瘤组织的磁靶向［66］。目前，仍有许多细菌趋向性机制需要探索，如趋热性、趋光性和趋电性［70］，这均离不开与纳米技术的结合。

2.3 提高治疗结果 目前，将减毒沙门菌、梭状芽孢杆菌和李斯特菌用于肿瘤治疗已进入临床试验阶段，在患者中未观察到明显的肿瘤消退。虽然细菌疗法表现出良好的安全性，但未能达到预期的治疗效果。因此，将细菌疗法与纳米技术结合，通过协同治疗增强治疗效果，该方法在临床应用中具有较大潜力［5，71］。

3 小结与展望

迄今为止，卡介苗是唯一获得FDA 批准的细菌类肿瘤治疗药物，虽然有许多基于细菌的肿瘤治疗方式正处于临床研究阶段，主要涉及到沙门菌、李斯特菌、新生梭状芽胞杆菌、大E.coli Nissle1917［72］，但结合纳米技术的细菌仍未开展临床研究。结合纳米技术的细菌用于肿瘤诊疗，能够将二者的优势互补结合，实现可视化递送、增强靶向性及提高治疗效果并降低副作用，在临床研究方面显示出巨大的潜力，但现阶段结合纳米技术的细菌仍有一些问题需要解决：①对于结合纳米技术的细菌制剂，纳米材料的负载效率会影响细菌的靶向性和安全性，过多的负载量会限制细菌的运动及对外界信号的响应；过低的负载量会大幅降低诊疗效果。另外，结合强度较低将会导致纳米材料在运输和细菌增殖过程中发生脱离，限制了其诊疗作用的发挥。因此，需将纳米医学、材料学与细菌结合研究，探索纳米材料与细菌的不同负载方式［73-74］。②细菌和纳米材料的安全性评价。细菌由于存在宿主免疫反应、固有的细菌毒性、遗传不稳定等问题，其安全性在临床试验中具有较大挑战［8］。纳米材料的被动积累及生物降解性需要研究人员进一步探索［75］，开发基于细菌的仿生纳米颗粒将受到广泛关注，结合纳米技术的细菌用于肿瘤诊疗需要立足于诊疗效果和安全性的平衡。细菌具有灵活的基因可编辑性，将为改善细菌治疗效果、降低毒力及细菌清除提供无限可能［71］。另外，在该过程中仍存在许多阻碍其向临床转化的问题，包括剂量依赖性、纳米材料的生产成本和质量可控性及培养系统的产业化等［76］。尽管结合纳米技术的细菌存在这些未解决的问题，作为一种新兴的肿瘤诊疗方式，将纳米技术与细菌的性质和优势结合，使两个或更多诊疗方法集成至单个微／纳米平台，从而产生更好的肿瘤诊疗效果，值得进一步深入研究。