仙茅盐蒸炮制工艺优选

张一美,王巍,李利华,朱琳,鞠成国,2

(1．辽宁中医药大学药学院,辽宁 大连 116600;2.国家中医药管理局中药炮制技术传承基地<辽宁>,辽宁 大连 116600)

仙茅为石蒜科植物仙茅(CurculigoorchioidesGaertn.)的干燥根茎,具有补肾阳、强筋骨、去寒湿的功效[1]。仙茅始载于《雷公炮炙论》,常用于肾阳不足、阳痿精冷、筋骨痿软、腰膝冷痛、寒虚崩漏、带下、痨虚内伤等临床病症[2]。仙茅的化学成分主要包括酚类、桉烷类、黄酮类、多糖类、木脂素类、生物碱类、挥发油等[3]。现代药理研究表明仙茅具有免疫调节、抗氧化、抗骨质疏松[4]、抗关节炎、抗肿瘤、保肝[5]、抗炎[6]、血管保护[7]等作用,临床上多用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、骨质疏松症、肾阳不足所致的阳痿早泄及更年期综合征等疾病[8]。

历代仙茅炮制方法主要有药汁制、泔水制、酒炒、酒浸、酒蒸等[9]。与古代炮制方法相比,现代炮制方法以酒炙法为主,而对盐制法记载较少。《贵州省中药饮片炮制规范》(1986年版、2005年版)中新增了“用淡盐水漂约1 h,沥干,蒸至上气”的记载[10-11],采用食盐水来对仙茅进行炮制,以更好地发挥仙茅补肾阳、祛风湿、强筋骨的功效。盐制中药始载于《雷公炮炙论》,根据辨证论治的需要,用盐制法炮制中药,取其引经、咸味、寒性、功用等作用,以改变或缓和药性,从而达到提高临床疗效的目的。而仙茅归肾经[1],中药炮制又有“入盐走肾脏”的传统理论,同时在中药理论中,五味中的咸味可以入肾。故选择用盐制法对仙茅进行炮制,以期通过其引药下行入肾的作用,来增强仙茅补肾壮阳、强筋健骨的作用。仙茅补肝肾、强筋骨的有效成分以酚苷类化合物为主,其中发挥补肝肾作用的有效成分之一为仙茅苷[12],《中国药典》2020年版中规定以仙茅苷为指标性成分进行仙茅的质量控制;仙茅中含量较高的成分有苔黑酚龙胆二糖苷和苔黑酚葡萄糖苷等,其为仙茅发挥强筋骨作用的有效成分[13]。本实验采用正交试验设计法,以盐水比例、闷润时间、蒸制时间为考察因素,以仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷含量及醇溶性浸出物为评价指标,优选盐蒸仙茅炮制工艺,以期为盐蒸仙茅饮片的规范化、科学化、工业化生产奠定理论基础。

1 材料

1.1 主要仪器C21-WT2118型电磁炉(美的集团股份有限公司);DFT-200型高速万能粉碎机(浙江温岭市林大机械有限公司);Waters e2695型高效液相色谱仪(Waters公司);XMTD-8222型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏试验设备有限公司);AE240型电子分析天平(梅特勒-托利多公司);KQ-250E型医用超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司);HH-4型数显恒温水浴锅(上海江星仪器有限公司);FA1004B型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)等。

1.2 药品与试剂仙茅苷对照品(批号:S0818AS,纯度>98%);苔黑酚龙胆二糖苷对照品(批号:J1014AS,纯度>98%)购自大连美仑生物技术有限公司;苔黑酚葡萄糖苷对照品(批号:1206A022,纯度≥98%)购自北京索莱宝科技有限公司;黄酒(批号:20210119,酒精度10%)购自浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司;食盐(批号:202204076)购自大连新春多品种盐有限公司;乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为娃哈哈纯净水。

仙茅药材(批号:2208001)购自安国市聚药堂药业有限公司,经辽宁中医药大学中药鉴定室李峰教授鉴定为石蒜科植物仙茅(CurculigoorchioidesGaertn.)的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 盐制仙茅的制备

2.1.1 盐炙法取生仙茅饮片20 g,置于密闭容器中,加入盐水(食盐:水=1∶15,每100 kg仙茅饮片用2 kg食盐)拌匀,闷润2 h,置于锅中,110～120 ℃翻炒5 min,取出,放凉,即得[14]。

2.1.2 盐蒸法取生仙茅饮片20 g,置于密闭容器中,加入盐水(食盐∶水=1∶17.5,每100 kg仙茅饮片用2 kg食盐)拌匀,闷润1 h,置于锅中,蒸制1 h,取出放凉,50 ℃干燥,即得。

2.1.3 酒炙法取生仙茅饮片20 g,置于密闭容器中,加入黄酒(10%,即生仙茅饮片质量的10%)拌匀,闷润,待黄酒被吸尽后,置于锅中,以文火炒干,取出,放凉,即得[15]。

2.2 醇溶性浸出物的测定按《中国药典》2020年版通则2201项下醇溶性浸出物测定法中的热浸法进行测定[16]。

2.3 仙茅苷等3种成分的含量测定

2.3.1 色谱条件①仙茅苷:以Xtimate C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱,以0.1%磷酸溶液-乙腈(76∶24,V/V)为流动相;流速1 mL·min-1;检测波长210 nm;柱温30 ℃;进样量 10 μL[17]。②苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷:以Xtimate C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)为色谱柱,以乙腈(A)-0.1% 磷酸溶液(B)为流动相进行梯度洗脱(0～7 min,95% B→90% B;7～20 min,90% B);流速0.6 mL·min-1;检测波长220 nm;柱温30 ℃;进样量10 μL[17]。

2.3.2 对照品溶液的制备精密称取仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷对照品适量,分别加入甲醇溶解稀释,混匀,制得仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龙胆二糖苷质量浓度分别为0.245 0、0.572 5、1.377 5 mg·mL-1的单一对照品母液[17]。

2.3.3 供试品溶液的制备取“2.1.2”项下盐蒸仙茅样品粉末(过三号筛,下同)1.0 g,精密称定,加入甲醇50 mL,称定质量,于水浴锅中加热回流2 h,取出放冷,再次称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过[1]。精密量取上述滤液20 mL,蒸干,残渣加入甲醇复溶,转移至10 mL量瓶中,加入甲醇稀释至刻度,摇匀,经0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得[1]。同法制得仙茅生品及盐炙品的供试品溶液。

2.3.4 系统适用性试验取上述各供试品溶液及单一对照品溶液适量,按“2.3.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱图,详见图1。

A.仙茅苷对照品(色谱条件①);B.供试品溶液(色谱条件①);C.苔黑酚龙胆二糖苷对照品(色谱条件②);D.苔黑酚葡萄糖苷对照品(色谱条件②);E.供试品溶液(色谱条件②) 1.仙茅苷;2.苔黑酚龙胆二糖苷;3.苔黑酚葡萄糖苷图1 各成分HPLC色谱图

2.3.5 线性关系考察分别精密吸取“2.3.2”项下各单一对照品母液适量,用甲醇稀释,制成仙茅苷质量浓度分别为7.70、15.30、30.60、61.30、122.50、245.00 μg·mL-1,苔黑酚龙胆二糖苷17.89、35.78、71.56、143.10、286.30、572.50 μg·mL-1,苔黑酚葡萄糖苷43.00、86.10、172.20、344.40、688.80、1 377.50 μg·mL-1的各单一对照品线性溶液,按“2.3.1”项下色谱条件进样测定。以各待测成分进样量(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归,计算各成分的回归方程及线性范围,结果见表1。

表1 各成分线性关系

2.3.6 精密度试验分别精密吸取“2.3.2”项下各单一对照品溶液适量,按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6次。计算仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷峰面积的RSD值,分别为0.44%、0.30%、0.27%(n=6),表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验取“2.3.3”项下供试品溶液(仙茅生品)适量,按“2.3.1”项下色谱条件进行测定,分别于0、2、4、8、12、24 h进样。计算仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷峰面积的RSD值,分别为0.13%、0.37%、0.21%(n=6),表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.3.8 重复性试验取仙茅生品样品粉末1.0 g,共6份,按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液,并按“2.3.1”项下色谱条件进行测定,计算仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷的平均含量分别为0.099%、0.387%、0.649%,RSD值分别为0.36%、0.54%、0.30%(n=6),表明该方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验精密称取6份已知含量的同一批次仙茅样品(生品)粉末,每份0.1 g,分别加入适量“2.3.2”项下各单一对照品溶液,按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液,并按“2.3.1”项下色谱条件进行测定,计算仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷的平均加样回收率分别为99.80%、95.94%、106.30%,RSD值分别为0.98%、1.61%、0.60%。

2.4 单因素试验本研究选择以盐水比例、闷润时间、蒸制时间进行单因素试验;同时,参考相关文献[13,16]确定各因素的权重,3种化学成分及醇溶性浸出物含量的权重均为25%。按以下综合评分公式进行计算:综合评分=(25%W/Wmax+25%X/Xmax+25%Y/Ymax+25%Z/Zmax)×100%。其中,W表示仙茅苷含量、X表示苔黑酚葡萄糖苷含量、Y表示苔黑酚龙胆二糖苷含量、Z表示醇溶性浸出物含量,Wmax表示仙茅苷含量的最大值、Xmax表示苔黑酚葡萄糖苷含量的最大值、Ymax表示苔黑酚龙胆二糖苷含量的最大值、Zmax表示醇溶性浸出物含量的最大值,综合评分分值越高表示样品质量越好[18]。

2.4.1 盐水比例取生仙茅饮片,每份 20 g,共5份,加入不同比例盐水(每100 kg生仙茅饮片,2 kg食盐),至密闭容器内闷润3 h后,蒸制1.5 h,取出放凉,50 ℃干燥。考察不同盐水比例(1∶5、1∶7、1∶10、1∶15、1∶20)对综合评分的影响。结果,当盐水比例为1∶15时,综合评分最高,而盐水比例1∶10存在盐水与饮片无法完全拌匀的情况,盐水比例1∶20存在盐水无法完全吸尽的情况,故选择盐水比例为1∶15正交试验设计,详见表2。

表2 不同盐水比例对综合得分的影响

2.4.2 闷润时间取生仙茅饮片,每份20 g,共5份,加入盐水比例为1∶15,至密闭容器内闷润不同时间后,蒸制1.5 h,取出放凉,50 ℃干燥。考察不同闷润时间(1、2、3、4、5 h)对综合评分的影响。结果表明,闷润1 h时,综合评分最高,其他时间分值相差不大,而闷润时间少于1 h时存在不能完全润透的情况,为节约时间,选择以闷润时间1～3 h进行正交试验设计,详见表3。

表3 不同闷润时间对综合得分的影响

2.4.3 蒸制时间取生仙茅饮片,每份 20 g,共5份,加入盐水比例为1∶15,至密闭容器内闷润1 h,蒸制不同时间,取出放凉,50 ℃干燥。考察不同蒸制时间(1、1.5、2、2.5、3 h)对综合评分的影响。结果表明,蒸制1 h时,综合评分最高,其他时间分值相差不大,而蒸制时间少于1 h时存在不能完全蒸透的情况,为节约时间,选择以蒸制时间1～2 h进行正交试验设计,详见表4。

表4 不同蒸制时间对综合评分的影响

2.5 正交试验

2.5.1 正交试验设计以单因素试验为基础,本研究以盐水比例(A)、闷润时间(B)、蒸制时间(C)为考察因素,以仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷和醇溶性浸出物含量的综合评分为评价指标,采用L9(34)正交表进行设计。酒蒸仙茅炮制工艺的因素与水平见表5,试验设计方案与结果见表6,方差分析结果见表7。

表5 正交试验因素水平表

表6 正交试验设计方案与结果

表7 正交试验方差分析

由表6可知,各因素对醇溶性浸出物及3种化学成分含量影响的大小顺序依次为B>A>C,最优组合为A3B1C1。由表7可知,因素A、B、C无显著影响(P>0.05),最终确定最优工艺为A3B1C1,即盐水比例1∶17.5、闷润时间1 h、蒸制时间1 h。

2.5.2 验证试验取生仙茅饮片,每份100 g,共3份,按上述最优盐蒸炮制工艺制备3份盐蒸仙茅样品,按“2.2”“2.3”项下方法分别测定含量,并计算综合得分,结果见表8。综合评分RSD值为1.62%,表明所得最优盐蒸仙茅工艺稳定、可行。

表8 验证试验结果

2.6 仙茅生品、盐炙品、盐蒸品及酒炙品含量比较取生仙茅饮片 20 g,按“2.1.1”“2.1.2”“2.1.3”项下方法分别制备盐炙品、盐蒸品和酒炙品,再按“2.2”“2.3”项下方法测定生仙茅饮及3种炮制品中醇溶性浸出物及仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷的含量,结果见表9。结果显示,盐蒸仙茅的醇溶性浸出物及仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷含量均高于仙茅生品、盐炙品和酒炙品。

表9 仙茅生品、盐炙品、盐蒸品及酒炙品含量比较

3 讨论

目前,对盐制仙茅的研究较少,有盐炙法和盐蒸法,其经盐制后的炮制机理和化学成分变化等尚不明确。盐制中药的方法最早于《雷公炮炙论》中就有所记载。经过历朝历代的不断发展创新,盐制饮片品种有所增加。沿用至今的方法多为盐炙法和盐蒸法,但盐炙法存在火力不均、火候难以控制等问题,而盐蒸法则能使饮片受热均匀,且由于其操作过程中处于密闭环境,减少了对饮片的污染。故本研究选择对盐蒸仙茅炮制工艺进行研究,以期提高临床疗效和用药安全性,为临床用药提供新思路。

本研究经实验考察,并以本课题组前期研究为参考[17],发现以“2.3.1”项下色谱条件测定仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷含量时,其色谱峰分离度较好、基线较为平稳。故选择以“2.3.1”项下色谱条件对其进行检测。

酚苷类成分是仙茅发挥补肝肾、强筋骨作用的物质基础[19],故本研究将醇溶性浸出物含量作为考察指标,同时选择《中国药典》2020年版中仙茅含量测定所规定的指标成分仙茅苷及仙茅酚苷类成分中含量较高的苔黑酚龙胆二糖苷和苔黑酚葡萄糖苷作为评价指标,以盐水比例、闷润时间、蒸制时间为考察因素,结合综合加权评分对工艺进行优化,得到仙茅盐蒸最佳工艺为取生仙茅饮片适量,置于密闭容器内,加入盐水(盐水比例1∶17.5,每100 kg仙茅饮片用 2 kg食盐)拌匀,闷润1 h,置于锅中蒸制1 h,取出放凉,50 ℃干燥,即得。经验证,结果表明所得最优盐蒸仙茅炮制工艺具有一定的科学性与可行性。随着中药炮制技术的演变,炮制工艺也在不断改进,炮制方法不断创新。但由于炮制工艺变化较大,中药成分较为复杂,本研究后续尚需对其质量标准、药理实验、化学成分分析、临床疗效等进行更深入的研究。