中药蟾酥的质量研究现状

石丽,焦阳,薛菲,陈娟,汪冰,林永强

(1.山东省食品药品检验研究院,国家药品监督管理局胶类产品质量评价重点实验室,中药标准创新与质量评价山东省工程研究中心,中药配方颗粒共性技术山东省工程研究中心,产业技术公共服务平台,山东 济南 250101;2.山东中医药大学,山东 济南 250355)

蟾酥是蟾蜍科动物中华大蟾蜍(BufobufogargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(BufomelanostictusSchneider)的耳后腺和皮肤腺体的干燥分泌物。多于夏、秋二季捕捉蟾蜍,洗净,挤取耳后腺和皮肤腺的白色浆液,加工,干燥而成,主产于河北、山东、四川等省。蟾酥甘辛、温,有毒[1],入心、胃、肾三经,具有解毒消肿,止痛,辟秽浊的功效[2-3],临床常用于疮痈肿毒、咽喉肿痛、暑天饮食不洁所致吐泻腹痛等[4]。属我国传统名贵动物药品种,也是国务院颁布的需要特殊管理的28种毒性中药品种之一,从《中国药典》1963年版开始,历版《中国药典》均有收载。

近年来,国家对中药质量要求不断提高,伴随着检测技术的进步,以及对药材研究的深入,蟾酥药材质量标准不断提高,更有利于加强对药材质量的控制。但由于蟾酥在临床上应用广泛、药物剂型多样,加之蟾酥自然资源有限,使得药材价格一路攀升,导致商品蟾酥品种基原混杂,掺杂、掺假现象时有发生,针对现有的研究情况,本文对近年来蟾酥药材质量研究情况进行综述。

1 蟾酥药材概况

蟾酥始载于唐代甄权所著的《药性论》,原名蟾蜍眉脂。首次以“蟾酥”记载于北宋寇宗奭所撰《本草衍义》的蝦麻项下,云:“多在人家渠堑下,大腹,品类中最大者是。遇阴雨或昏夜即出食。取眉间有白汁,谓之蟾酥。 以油单裹眉裂之,酥出单上,入药用。有人病齿缝中血,以纸仟子蘸干蟾酥于血出处,按之立止。”明代陈嘉谟所著《本草蒙筌》:“眉间白汁,乃名蟾酥。刺取之时,先防射目。(沾之即瞎)。”以上记载的蟾酥采制方法与现今蟾酥一致。

明清时期有多部古籍记载蟾酥的药理作用。《本草正》:“味辛麻,性热,有毒。主治发背痈疽疔肿一切恶毒。若治风虫牙痛,及齿缝出血,以纸捻蘸少许点齿缝中,按之即止。”《本草纲目》:“治发背疔疮,一切恶肿。”《医学入门》:“主治疽疔肿瘰疬,一切恶疮顽癣。”《本草汇言》:“蟾酥,疗疳积,消臌胀,解疔毒之药也。能化解一切瘀郁壅滞诸疾,如积毒、积块、积胀、内疔痈肿之证,有攻毒拔毒之功也。”《本草征要》:“蟾酥,味辛、性温,有毒。入胃、肾二经。发背疔疽,五疳羸弱,立止牙疼,善扶阳事。”还有像《本草备要》《本草分经》《赤水玄珠》《本草求真》《本草便读》等。到现代,《中药大辞典》载:“蟾酥,性味辛、凉、有毒,能破瘾结,行水湿,化毒,杀虫,定痛。 治疗疮、发背、阴疽瘰疬,恶疮,癥瘕积聚,鼓胀,水肿,小儿疳积,慢性气管炎。”以上记载,均体现了蟾酥消肿、止痛、止血等的功效,这与蟾酥现代药理学研究结果一致,现代药理学还研究了蟾酥强心、抗癌、局麻等的功效。

2 影响蟾酥质量的因素

蟾酥质量受到多种因素的影响,包括品种基原、加工方式及炮制方法等,致使商品蟾酥质量差异较大,这些问题给蟾酥的质量控制带来很大的挑战。目前对蟾酥质量的研究主要集中于不同品种及不同资源分布地区蟾酥质量差异、蟾酥采集后初加工方式和不同炮制方式的影响。

2.1 品种蟾酥在历代古籍及现代书籍中有多个别名。其最初记载名为“蟾酥眉脂”,又名蟾蜍眉酥,《本草衍义》方有“蟾酥”之名。到现代有蛤蟆浆、蛤蟆酥等俗称。这与蟾酥产地众多有关。历代古籍中,《神农本草经疏》:“蟾蜍、虾蟆,本是二物。经云:一名蟾蜍者,盖古人通称蟾为虾蟆耳。经文虽名虾蟆,其用实则蟾蜍也。今世所用者皆蟾蜍,而非虾蟆,其功益可见矣。”又有《本草品汇精言》《绍兴本草》等古籍中所提及虾膜今指蛤蟆,即蛙。到了现代《中国药典》规定其来源是中华大蟾蜍(BufobufogargarizansCantor)或黑眶蟾蜍(BufomelanostictusSchneider)。

据文献及资料调查,蟾蜍分布广泛,世界各地均有分布。由中国科学院昆明动物研究所所创办的中国两栖类(www.amphibiachina.org)网站,已收载中国两栖类物种596种(截至2022年4月17日)。其中,蟾蜍科品种众多,总共记载有6属20多种,包括蟾蜍属、头棱蟾属、花蟾属、小蟾属、棱顶蟾属、漠蟾属。中华大蟾蜍(Bufogargarizans),俗称癞蛤蟆,属于两栖纲,无尾目,蟾蜍科,蟾蜍属。黑眶蟾蜍(Duttaphrynusmelanostictu)属于两栖纲,无尾目,蟾蜍科,头棱蟾属。目前市场上常见的花背蟾蜍(Strauchbuforaddei)属于蟾蜍科,花蟾属。除了分布最广的中华大蟾蜍、黑眶蟾蜍及花背蟾蜍之外,蟾蜍属还记载有10种,头棱蟾属有3种。而大多数文献及资料现在将黑眶蟾蜍划分在蟾蜍属下,查阅中国动物主题数据库,也只精确到蟾蜍科。所以关于黑眶蟾蜍的种属问题有待进一步明确。加上现在蟾酥药源的紧缺,以及中华大蟾蜍栖息地逐渐减少和人为乱捕滥杀,市场上流通的品种多样,一些非药典品种像花背蟾蜍、华西蟾蜍等,也在市场上流通。

早在1992年,金向群等[5]对中华大蟾蜍、黑眶蟾蜍、花背蟾蜍、华西蟾蜍4种动物的耳后腺分泌物,用薄层层析法测定其中蟾毒配基类化合物的含量,发现中华大蟾蜍耳后腺分泌物中蟾毒配基类化合物含量较高,华西蟾蜍耳后腺分泌物未检出华蟾毒精,但其他几种蟾毒配基类化合物含量均较高。缪珠雷等[6]对不同蟾蜍品种来源的蟾酥华蟾酥毒基和脂蟾毒配基进行测定,发现中华大蟾蜍、花背蟾蜍、华西蟾蜍含量呈现一定变化,但这种差异尚不明确是否由品种不同导致。张屏[7]对不同基原蟾酥类的HPLC指纹图谱研究中,得到中华蟾酥、黑眶蟾酥、华西蟾酥、花背蟾酥的HPLC指纹图谱,从分析技术上澄清了混乱品种。

2.2 产地有很多研究显示,不同产地蟾酥主要成分差异显著。在这些研究中,样品产地溯源和物种鉴定中存在一些问题,所检测蟾毒配基类成分不一。刘小英等[8]使用购买的黑眶蟾酥成品,作为不同产地的蟾酥样品,检测日蟾毒它灵、蟾毒灵、沙毒精、华蟾毒配基和脂蟾毒配基的含量。毛佩芝等[9]使用公司提供的10个产地来源的中华大蟾蜍浆液新鲜冷冻样品,检测日蟾毒它灵、蟾毒他灵、远华蟾蜍精、华蟾毒他灵、蟾毒灵、华蟾毒配基和脂蟾毒配基的含量。缪珠雷等[7]使用公司提供的蟾蜍浆液(采集和收购过程有专人现场监督),自行制成成品蟾酥,测定华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量。还有研究结合指纹图谱技术,对不同产地的蟾酥样品进行研究,建立指纹图谱。成小兰等[10]使用10批不同产地的蟾酥药材,建立蟾酥的HPLC指纹图谱,不同批次蟾酥样品相似度均较高。

产地造成蟾酥质量差异的原因可能是不同地区气候因素差异导致蟾毒配基成分生物合成的变化。另外,蟾酥产地初步鉴别的特征性成分可以进一步寻找,以便更好地区分不同产地的蟾酥样品,需要注意的是为了避免市场流通对蟾酥来源的可能影响,所使用的样品最好是从确定产地的蟾蜍中采集得到的。

2.3 采集和初加工蟾酥在采集和初加工过程中,可能会受到采浆方法和成酥制作过程的影响,对成品蟾酥的质量产生很大影响。刮浆时要注意掌握正确的刮浆部位,用夹子挤浆时动作要快、轻重要适宜,还要注意制取使用的工具,要做到取浆完毕后的蟾蜍仍能正常生长,以保护资源。如果操作过程不规范,都会影响到蟾酥的质量。浆液采集后的加工炮制工艺也是蟾酥质量优劣的关键,目前研究较多的影响因素是过滤和干燥方式。

蟾酥鲜浆采集后应先过滤后再进行加工,因为采集后的鲜浆中可能会掺杂着杂质,会使蟾酥外观品质下降。目前的文献研究[11-13],对过滤所需的铜筛的目数并不统一,这也有待进一步的规范。

目前蟾酥产地加工中采用的干燥方法较多,有阴干、晒干、冷冻干燥等。不同干燥方法对蟾酥外观质量及化学成分含量产生较大影响,使得蟾酥质量和临床疗效产生较大差异。吴世福等[14]对蟾酥不同干燥方法进行比较研究,以水分含量和3种蟾毒配基类成分的含量为指标,检测室内避光阴干、室内晾晒、室外晒干、45 ℃烘干、80 ℃烘干5种不同干燥方法对蟾酥质量的影响,发现室内避光阴干是最好的干燥方法。曲婷等[15]以5种吲哚生物碱和5种蟾毒配基的含量为指标,考察鲜蟾酥样品 5种干燥方式:105 ℃烘干、80 ℃烘干、60 ℃烘干、60 ℃减压干燥、冷冻干燥对蟾酥药材的影响,通过对比发现冷冻干燥是最优的干燥方式。陈瀛澜等[16]考察蟾酥鲜浆5种干燥炮制加工方式(日晒干燥、50 ℃真空干燥、50 ℃真空干燥、50 ℃鼓风干燥、80 ℃鼓风干燥、冷冻干燥)前后化学成分及药效变化,通过性状、7种蟾毒配基类成分含量及肿瘤细胞抑制效果的对比,发现5种干燥方式产生的蟾酥样品性状及肿瘤细胞的抑制有差异,但对7种蟾毒配基类成分的影响不是很大,而冷冻干燥的蟾酥华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量之和大于其他的干燥方法。

2.4 炮制方式蟾酥有毒,临床用药多经炮制,蟾酥的现代炮制以酒制法为主流[17]。历版《中国药典》收载的蟾酥饮片均为蟾酥粉,亦称酒蟾酥。地方炮制规范除收载酒蟾酥外,还收载了乳制蟾酥、制蟾酥、蟾酥片等[18]。不同地方的炮制方法在辅料和用量上会存在差异。因此,对蟾酥炮制工艺进行规范化研究,制定生产过程中的技术规范和标准,是保证成品质量,从而保障其临床疗效的前提。

曲婷等[16]对蟾酥药材采用酒制和乳制两种炮制方法制备相应的饮片,测定炮制品中5种吲哚生物碱和5种蟾毒配基的含量,发现酒制和乳制对蟾酥中这些成分的含量基本无影响。沈嘉茵等[17]采用HPLC法,以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量为评价指标,选择市售白酒、牛奶、滑石粉作蟾酥炮制辅料以单因素和正交试验考察炮制工艺,最终筛选出蟾酥酒炮的最佳工艺:加入两倍量55%乙醇,在60 ℃炮制12 h,干燥,粉碎。袁旭江等[19]采用正交法优化蟾酥酒炮工艺,筛选出蟾酥酒炮最佳工艺为:乙醇浓度为55%,药辅比为1∶2,在60 ℃炮制12 h。

3 蟾酥药材质量控制技术

蟾酥缺乏平常药材(或饮片)固有的外观形态,不能依靠性状鉴别区分。除了性状鉴别、显微鉴别等方法之外,还有一些现代分析技术,逐渐应用到蟾酥质量评价过程中。

3.1 HPLC指纹图谱技术中药指纹图谱技术是一种综合的、整体的鉴定手段,可较全面地反映药材/饮片的化学成分以及特征峰面积的相对比例,为蟾酥药材的质量评估提供了一个综合平台。在指纹图谱分析的基础上,结合多元统计分析进行化学模式识别,可以呈现出指纹图谱的异同,可在药材/饮片质量、产地等的判别中克服主观因素,更加准确地对药材进行质量评价,应用广泛[10,20]。

自《中国药典》2000年版中修改含量测定用HPLC法后,针对蟾酥含量测定的研究逐渐增多。直到《中国药典》2020年版在含量测定基础之上,增加蟾酥特征图谱的检查。在此之前,张屏[7]对不同基原蟾酥样品构建HPLC指纹图谱,以15个不同产地的中华大蟾酥样品构建13个共有峰的中华大蟾酥指纹图谱,以5个不同产地的黑眶蟾酥样品构建12个共有峰的黑眶蟾酥指纹图谱。以3个不同产地的花背蟾酥样品构建12个共有峰的花背蟾酥指纹图谱,以3个不同产地的华西蟾酥样品构建11个共有峰的华西蟾酥指纹图谱,此外还包括一个岷山蟾酥和一个未定名蟾酥的指纹图谱。朱玲英等[21]使用公司提供的10个蟾酥样品,构建出10个共有峰的蟾酥药材的指纹图谱。张东红等[22]对收集的18个不同产地的蟾酥鲜浆进行指纹图谱研究,建立起12个共有峰的蟾酥鲜浆指纹图谱。王鹏飞等[23]等对收集到的15批不同产地市售蟾酥样品,用UPLC-QTOF-MS分析建立了蟾酥药材的特征图谱,10个共有峰包含了5个吲哚生物碱成分和5个蟾毒配基类成分。成小兰等[10]收集10个不同产地的蟾酥样品,建立了蟾酥的HPLC指纹图谱,以10个色谱峰为指纹图谱共有峰,对照品指认了3个主要色谱峰,结合主成分分析10个样本聚为3类,反映出不同产地的蟾酥样品之间也有差异,但没有进一步寻找差异成分。房蕴歌等[24]对蟾酥药材和饮片(蟾酥粉)的质量标准研究中,在前人研究的基础上,对收集的38批不同产地的蟾酥药材建立HPLC特征图谱,以5个蟾毒配基类成分作为特征峰。同时也有一些针对蟾酥制剂的指纹图谱研究[25-28]。

不难发现,这些研究的主要差别在于样品,要收集足够多、范围足够广的样品,使样品更具代表性。问题在于:①从市场收集的样品并没有产地溯源;②没有对样品进行物种鉴定。所以结论不能和产地或物种进行良好的关联,不利于蟾酥质量控制的整体研究。

3.2 一测多评王志民等[29]等提出的一测多评法解决了对照品缺乏和多指标检测高昂的检测成本的难题,实现对中药的多成分质量控制。《中国药典》2020年版蟾酥药材的含量测定即采用一测多评法。在这之前,王鹏飞等[23]首先采用一测多评法对收集的15批不同产地的蟾酥样品进行5种主要蟾毒配基的含量测定,以华蟾酥毒基为内参物,测定同类成分日蟾毒它灵,蟾毒它灵,蟾毒灵和脂蟾毒配基的含量。房蕴歌等[25]在前文分析的基础上,细化分析相对校正因子的计算方法和计算波长,并进行验证,最终确定纳入标准正文的相对校正因子。还有研究运用一测多评法对蟾酥制剂进行含量测定[30-34],考察其可行性。

3.3 其他方法动物源性中药中富含蛋白质、多肽等大分子物质,它们与植物药材中小分子化合物有很大的不同,而动物源性中药的正确使用对其应用、安全性和可持续性至关重要。蛋白质组学技术可以检测鉴别中药样品中的特征蛋白,鉴别其来源、品种等[35-37]。房蕴歌[38]在以蟾酥为例探讨“TOE”思路下的动物药质量控制内涵研究中,对蟾酥中蛋白类成分进行研究,采用SDS-PAGE、NanoLC-MS/MS技术和生物信息学手段,对不同基原样品的蛋白成分进行比较研究,并筛选基原间相互区分的生物标志物。王子月等[39]在基于纳升液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱高分辨质谱技术研究蟾酥鲜品中的蛋白质中,鉴定出407种蛋白质和880种多肽序列,并对蟾酥鲜品中的蛋白质组进行功能注释及分类,发现这些蛋白涉及多种信号通路,为发现这些蛋白和其功能研究提供了实验依据。

4 蟾酥药材质量标准研究变革及现状

自《中国药典》1963年版收载蟾酥以来,后续各版药典不断提高完善。在地方标准中,蟾酥曾收载于台湾1985版二册、蒙药1986版、新疆1980版二册,现由于蟾酥统一执行药典标准,地方标准已不再收载。表1罗列了各版药典收载的项目以及变化情况。

表1 各版药典收载情况及变化

蟾酥现行标准除《中国药典》外,在香港特别行政区还需要符合《香港中药材标准》[49](下文简称“港标”)中对蟾酥的质量要求。两个标准执行适用的地域不同,收载的项目和限度也存有差异。现将《中国药典》和《香港中药材标准》的项目设置和细节的不同之处进行了对比,详见表2。

表2 《中国药典》和《香港中药材标准》的项目对比

总体而言,蟾酥的质量标准经过50多年的变革,较之前有较大提升,与港标相比,质控思路和方法基本一致,细节多有不同,港标收载的检查项目更加全面,药典对部分项目的限度规定更加严格。

5 存在问题和展望

蟾酥化学成分复杂,目前关于其化学成分和药理作用的研究越来越多。蟾酥制剂也广泛地应用于抗炎、强心等方面,目前关于蟾酥抗癌作用的研究也越来越多。但中药蟾酥的使用受限于品种基原、产地、加工方式等因素的影响,要想更好地应用到临床上,质量控制的研究也是必不可少的。现行的蟾酥标准收载的质控项目已经较为完善,可以实现基本的质量控制,但是还未从根源上解决蟾酥的基原鉴别问题。蟾酥不易获得,人工养殖受限,市场需求不断扩大,不良商贩在利益驱动下制假造假,为更好地进行药材质量把控,必须要跟随市场变化而不断探索提高检测水平,建立更全面、更易识别的蟾酥质量评价模式,有效提高蟾酥质量、保障临床用药安全。