基于TLR4/MYD88/NF-κB通路研究降脂通脉饮对高脂血症模型大鼠的影响*

郭锦荣,朱立新,彭垒,张鞠华,周芬敏,陆瑞峰

上海健康医学院附属周浦医院,上海 201318

高脂血症是指由于脂肪代谢或功能异常导致血液中的脂质或脂蛋白水平异常升高,其病因主要包括饮食失调、肥胖、遗传性疾病(如家族性高胆固醇血症)或其他疾病(如糖尿病)[1]。高脂血症的主要特征是高密度脂蛋白水平降低,总胆固醇(total cholesterol,TC)、三酰甘油(triglyceride,TG)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平升高。临床研究表明,高脂血症在心血管疾病的发生发展中起关键作用[2-3]。临床上,高脂血症的治疗药物包括他汀类药物、贝特类药物、胆酸螯合剂和烟酸等[4-6]。尽管这些降血脂药物能有效降低血脂水平,但长期使用可能会引起诸多不良反应,如腹胀、腹泻、肌肉无力、肌肉溶解等[7]。因此,研发新型降血脂药物预防和治疗高脂血症迫在眉睫。

研究表明,炎症反应与早期动脉壁脂质沉积密切相关[8],且在高脂血症进展中扮演着重要角色[9-10]。LDL是体内运输内源性胆固醇的主要载体,其水平升高可通过调节白细胞活性、干扰细胞因子从而引发炎症反应[11]。在这些复杂过程中,炎症介质大量产生,并参与血管内皮损伤及斑块形成[12-13]。研究证实,Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/髓样分化因子 88(myeloid differentiation factor 88,MYD88) /核转录因子-κB (nuclear transcription factor-κB,NF-κB)通路在慢性炎症、动脉粥样硬化中发挥重要作用[14]。Toll样受体是先天免疫系统中的模式识别受体,负责识别病原体及受损相关的分子模式,从而触发炎症级联反应[15]。TLR4是TLR家族中最早被发现的成员,与先天性免疫、代谢紊乱(如高脂血症)密切相关[16]。TLR4 可被众多外源性和内源性危险信号分子激活[17-18],进而通过MYD88依赖性途径传递信号,进一步激活NF-κB,最终促进炎症因子如白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)释放[19]。

降脂通脉饮具有补虚祛邪、化解痰浊血瘀之功效[20]。该方治疗高脂血症的临床疗效显著,目前尚不清楚其作用机制是否与TLR4/MYD88/NF-κB通路有关。本研究拟采用高脂饲料喂养的方式建立高脂血症大鼠模型,并观察降脂通脉饮对大鼠血脂及TLR4/MYD88/NF-κB通路的影响,以期为高脂血症的临床治疗提供基础依据。

1 材料

1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠15只,6周龄,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号：SCXK(京)2012-0001。动物饲养于上海健康医学院分子生物学实验室 SPF级动物房,环境温度25 ℃,相对湿度60%,12 h/12 h昼夜明暗交替。本研究经过上海浦东新区周浦医院动物伦理委员会审核批准(伦理审批号：ZPYYLL-2018-02)。

1.2 药物与试剂降脂通脉饮(茶树根、制首乌、山楂、泽泻、黄精、陈皮、半夏、益母草等,北京康仁堂药业有限公司制备颗粒剂,批号：23012031);qPCR试剂盒(诺唯赞,货号：R223-01);TLR4抗体、MYD88抗体(Abcam,货号：ab22048、ab219413);NF-κB抗体(Cell Signaling Technology,货号：8242);GAPDH抗体、ECL化学发光液(碧云天生物,货号：AF0006、P0018S);TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、干扰素-γ(interferon gamma,IFN-γ)试剂盒(碧云天生物,货号：PC125、PT512、PI508)。

1.3 仪器实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司,型号：ABI7900);垂直电泳槽、电转仪(北京六一仪器厂,型号：DYCZ-24DN、DYCZ-40);离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司,型号：HI650);水平电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司,型号：JY300);电热恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表有限公司,型号：HW-SY11-KP2);全自动生化仪(迈瑞,型号：BS-350S)。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药从15只SD大鼠中随机选取3只作为空白组,其余大鼠给予高脂饲料2周建立高脂血症模型,高脂饲料由81.3%普通饲料、10%猪油、5%白糖、3%胆固醇、0.5%胆盐和0.2%甲硫氧嘧啶组成。将造模成功的大鼠随机分为模型组、降脂通脉饮低剂量组(1.56 mg·kg-1)、降脂通脉饮中剂量组(3.13 mg·kg-1)、降脂通脉饮高剂量组(6.25 mg·kg-1),每组各3只,药物组给予相应剂量降脂通脉饮灌胃,空白组和模型组给予生理盐水灌胃(10 mL·kg-1),每日1次,持续8周。灌胃期间,空白组给予普通饲料,其余各组给予高脂饲料。

2.2 样本制备末次灌胃后,大鼠禁食12 h,腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液(45 mg·kg-1)麻醉,颈动脉采血,冰上放置2 h,3 500 r·min-1离心10 min,取上清,4 ℃保存备用。

2.3 血脂水平检测全自动生化仪检测大鼠血清血脂水平,包括TC、TG、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平。

2.4 ELISA检测血清炎症因子含量根据试剂盒说明书的步骤进行操作,检测各组大鼠血清MCP-1、TNF-α、IFN-γ含量,每个样品设3个复孔。

2.5 qPCR检测颈动脉组织TLR4mRNA、MYD88mRNA、NF-κBmRNA表达情况用Trizol试剂提取颈动脉组织总RNA,紫外分光光度计检测RNA含量;逆转录酶试剂盒合成cDNA,反转录体系：HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ(5×)4 μL、RNA (1 000/CRNA),RNase free ddH2O(16-VRNA)补足体系至 20 μL,反应条件：37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s,4 ℃ ∞,4 ℃ 保存;qPCR反应扩增体系：SYBRTMGreen Master Mix 5 μL、上游和下游引物各0.4 μL、cDNA 0.6 μL,RNase free ddH2O 3.6 μL,扩增条件：95 ℃ 2 min、变性95 ℃ 20 s,退火15 s、延伸72 ℃ 30 s,循环40次。内参基因选择GAPDH,每个样品设3个复孔,以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。使用Primer 5软件设计引物,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物,引物序列见表1。

2.6 Western Blot检测颈动脉组织TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表达水平提取颈动脉组织总蛋白,采用考马斯亮蓝G-250检测蛋白含量;配置SDS-PAGE 凝胶,上样10 μg,电泳条件：60 V(30 min)-80 V(20 min)-120 V(10 min);转膜条件：250 mA(90 min);5%脱脂牛奶室温封闭1 h,室温孵育一抗(11 000)2 h,TBST洗膜3次,每次 5 min;室温孵育二抗(15 000)2 h,TBST洗膜3次,每次5 min;配置ECL化学发光液,在Amersham Imager 600 曝光机下扫描蛋白条带并拍照,Image J软件分析蛋白条带灰度值,以GAPDH作为内参蛋白,计算目的蛋白的相对表达量。

3 结果

3.1 降脂通脉饮对各组大鼠血脂水平的影响与空白组比较,模型组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平升高(P<0.01);与模型组比较,降脂通脉饮低剂量、中剂量、高剂量组大鼠血清TC、TG、LDL-C水平降低(P<0.05);各组大鼠血清HDL-C水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),见图1。

注：与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。

3.2 降脂通脉饮对各组大鼠血清炎症因子含量的影响与空白组比较,模型组大鼠血清MCP-1、TNF-α、IFN-γ含量升高(P<0.01);与模型组比较,降脂通脉饮中剂量、高剂量组大鼠血清MCP-1、TNF-α、IFN-γ含量降低(P<0.05),降脂通脉饮低剂量组大鼠血清TNF-α、IFN-γ含量降低(P<0.05),见图2。

注：与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。

3.3 降脂通脉饮对各组大鼠颈动脉组织TLR4mRNA、MYD88mRNA、NF-κBmRNA水平的影响与空白组比较,模型组大鼠TLR4mRNA、MYD88mRNA、NF-κBmRNA表达水平升高(P<0.01);与模型组比较,降脂通脉饮低剂量、中剂量、高剂量组大鼠TLR4mRNA、MYD88mRNA、NF-κBmRNA表达水平降低(P<0.05),见图3。

注：与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。

3.4 降脂通脉饮对各组大鼠颈动脉组织TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表达水平的影响与空白组比较,模型组大鼠TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表达水平升高(P<0.01);与模型组比较,降脂通脉饮中剂量、高剂量组大鼠TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表达水平降低(P<0.05,P<0.01),见图4。

注：与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01。

4 讨论

近年来,由于高胆固醇摄入、缺乏锻炼等原因,高脂血症患者急剧增加[21]。大量研究表明,高脂血症的发病机制包括炎症反应、氧化应激、内质网应激等[22-23]。过量摄入高脂饮食可能引发血脂代谢紊乱和慢性炎症,进而加剧动脉管腔狭窄[24-25]。同时,高脂肪和高胆固醇饮食会导致血清TC和游离脂肪酸水平升高,从而引发全身氧化应激和炎症状态[26]。临床研究证实,高脂血症是引发冠状动脉粥样硬化、心力衰竭、心肌炎的主要危险因素之一[27]。因此,高脂血症的治疗目的不仅是纠正血脂水平异常,还要预防动脉粥样硬化,最终降低动脉粥样硬化性疾病的发病率和病死率。

在中医学中,高脂血症归属于“痰浊”“眩晕”等范畴,其发病主要与肝、肾、脾三脏功能失调有关。由于日常饮食无所节制,加之七情伤劳,可能导致正虚痰瘀的病理状态。治疗时应注意标本兼治,临床多采用调理脾胃、滋养肝肾治本,化痰逐瘀、理气化浊治标的方法。临床研究表明,降脂通脉饮可有效调节患者血脂水平,并改善相关症状。本研究采用高脂饮食建立高脂血症模型,其模拟人类的异常脂质代谢状态,是研究降脂药物药理作用的良好模型[28]。实验结果表明,降脂通脉饮可降低高脂血症大鼠血脂水平,其疗效与临床观察相符。

多项研究表明,TLR4/MYD88/NF-κB通路在慢性炎症、动脉粥样硬化以及调控心肌组织炎症反应中起重要作用[14,29-30]。Toll样受体,特别是TLR4,是当前研究最为深入的模式识别受体之一。TLR4在促进动脉粥样硬化中起关键作用,研究表明TLR4的全身缺失可抑制高胆固醇血症诱导的动脉粥样硬化[14]。MYD88作为TLR4信号通路的主要适配分子之一[31-32],其功能失活可通过减少巨噬细胞对动脉壁的募集及降低趋化因子水平从而缓解动脉粥样硬化[15]。在炎症状态下,TLR4/MYD88信号的激活会导致下游NF-κB激活,因此TLR4/MYD88/NF-κB通路是高脂血症引起炎症反应的关键通路。本研究中,模型组大鼠颈动脉组织TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表达水平降低,而降脂通脉饮大鼠TLR4、MYD88、NF-κB蛋白表达水平升高。由此说明,降脂通脉饮可有效抑制TLR4/MYD88/NF-κB通路,从而缓解炎症反应。

综上所述,降脂通脉饮可降低高脂血症大鼠血脂水平,其机制可能与抑制TLR4/MYD88/NF-κB通路,从而减轻炎症反应有关。