高温瞬时灭菌对开心散有效成分含量及微生物学指标的影响△

李俊莹，许倩，秦绍刚，汪梦美，汪海宣，杜明松，陈万青，张功茹，年立忠，单晓晓，彭灿，金传山，张彩云*

1.安徽中医药大学 药学院，安徽 合肥 230012；

2.药物制剂技术与应用安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；

3.安徽省教育厅现代药物制剂工程技术研究中心，安徽 合肥 230012；

4.安徽省道地中药材品质提升创新协同中心，安徽 合肥 230012；

5.安徽省中医药科学院 药物制剂研究所，安徽 合肥 230012；

6.中药复方安徽省重点实验室，安徽 合肥 230012；

7.合肥市食品药品检验中心，安徽 合肥 230094；

8.蚌埠丰原涂山制药有限公司，安徽 蚌埠 233000

开心散始载于唐代医家孙思邈所著《备急千金要方》，由远志、人参、茯苓和石菖蒲4 味中药组成，具有安神益智、开窍醒脑等功效，是中医临床防治健忘、阿尔茨海默病的基础方剂，也是2018 年国家中医药管理局制定的首批百首经典名方之一[1-2]。开心散为中药散剂，需参照《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版中口服散剂的质量标准进行研究。由于其是生药入药，需经灭菌来保证其中微生物限度达到临床应用的安全标准[3]。

目前，中药饮片及制剂常见灭菌方法有干热灭菌、湿热灭菌、紫外线灭菌、辐射灭菌、臭氧灭菌等，不同灭菌方法对开心散有效成分的影响不同[4-5]。干热灭菌法的热穿透力差，须经长时间高温作用才能达到灭菌的目的，适用于耐高温及湿热条件下易分解的药品[6]。干热灭菌法不适用于开心散中含有黄酮类成分的远志和含有挥发油成分的石菖蒲。湿热灭菌法是药物制剂生产过程中最常用的灭菌方法，但灭菌后样品潮湿、水分超标，导致某些中药药性转变，易吸潮或吸潮后物性易改变的中药不建议使用该法[7]。紫外线灭菌法有灭菌不均匀、不完全、灭菌时间长、会产生臭氧残留等不足[8]。辐射灭菌法存在辐照剂量超标与辐照源受限制的弊端[9]。臭氧灭菌法易使部分中药活性成分氧化，且臭氧稳定性差[10]。

高温瞬时灭菌是近年来兴起的新技术，是在加热条件下使纯净饱和蒸气迅速达到较高温度，短时间内破坏病原微生物细胞内的蛋白质、核酸和活性物质，达到灭菌的目的；灭菌后，系统会将物料分离并进行急骤冷却，药效成分损失少，灭菌效率高、效果好[11-12]。该法可对含生药原粉的中成药进行迅速灭菌与干燥，保持原生药原粉的药效特性。开心散中含有易水解和易挥发的成分[13-16]，通过前期不同颗粒尺寸灭菌效果和含量预试验考察，最终确定对10目以下（优选2～8 目）开心散样品进行高温瞬时灭菌研究。本研究选择远志酮Ⅲ、3,6ʹ-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、茯苓酸、β-细辛醚和α-细辛醚8个活性成分作为灭菌前后的质量控制指标[17-18]，比较不同灭菌条件对8 个有效成分含量变化的影响，以期确定开心散高温瞬时灭菌最佳灭菌工艺参数。

1 材料

1.1 仪器

UltiMate 3000 型高效液相色谱仪（Thermo Fisher Scientific 公司）；KS-250TDE 型超声波清洗器（昆山洁力美超声仪器有限公司）；MS105DU/A型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；Milli-Q Advantage A10 型超纯水系统（默克仪器有限公司）；WC-KLD20 型高温瞬时灭菌设备（江苏万创灭菌设备科技有限公司）。

1.2 试药

开心散配方中远志（批号：202201）、人参（批号：202201）、茯苓（批号：202101）和石菖蒲（批号：202201）饮片均购自安徽敬道药业有限公司，经安徽中医药大学俞年军教授鉴定，远志为远志科远志属植物远志Polygala tenuifoliaWilld.的干燥根、人参为五加科人参属植物人参Panax ginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎、茯苓为多孔菌科茯苓属真菌茯苓Poria cocos(Schw.) Wolf 的干燥菌核、石菖蒲为天南星科菖蒲属植物石菖蒲Acorus tatarinowiiSchott 的干燥根茎。以上饮片按《中国药典》2020年版（一部）要求项检测均为符合规定[19]。

2 方法

2.1 开心散中4味中药粗颗粒的灭菌

将远志、人参、茯苓和石菖蒲4 味中药进行粗粉碎，得到2～8 目的粗颗粒，分别称取300 g，投入高温瞬时灭菌设备进行灭菌。依据高温瞬时灭菌设备的最低工作温度（160 ℃）、结合开心散方中挥发油类成分的特点，分别设定160、165、170 ℃ 3 个灭菌温度，灭菌时间分别为5、7、9 s，开启设备灭菌操作。灭菌物料进入灭菌仓，在搅拌桨快速搅拌过程中与过热蒸气充分接触，借助多角度温度传感器精确控制灭菌温度[（设定温度±1）℃]，实现高温、瞬时、均匀灭菌。待灭菌结束后，在出样口用无菌采样袋分装样品，并依据灭菌温度和灭菌时间分别将其标记为160 ℃、5 s，160 ℃、7 s，160 ℃、9 s，165 ℃、5 s，165 ℃、7 s，165 ℃、9 s，170 ℃、5 s，170 ℃、7 s，170 ℃、9 s。

2.2 开心散样品的制备

在洁净区无菌环境下，分别粉碎9 种灭菌条件的粗颗粒，并通过六号筛进行筛分。最后按照2022年9 月发布的《国家中医药管理局办公室、国家药品监督管理局综合和规划财务司关于发布＜古代经典名方关键信息表（25 首方剂）＞的通知》中开心散关键信息[20]，将远志-人参-茯苓-石菖蒲按1∶1∶2∶1 的比例混合均匀，制备开心散散剂。

2.3 微生物限度检测

参照《中国药典》2020 年版（四部）中非无菌产品微生物限度检查微生物计数法（通则1105）、控制菌检查法（通则1106）和非无菌含药材原粉的中药制剂的微生物限度标准（通则1107），对灭菌前后的开心散进行微生物限度检测[3]。

2.4 开心散有效成分的含量测定

2.4.1 供试品溶液的制备 精密称取开心散粉末1 g置塞锥形瓶中，加入75%甲醇25 mL，超声提取30 min（250 W，50 kHz）后滤过，滤液过微孔滤膜（0.45 µm）后取续滤液，即得。

2.4.3 高效液相色谱法（HPLC）条件Agilent C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相梯度洗脱（0～20 min，5%～15%A；20～26 min，15%～16%A；26～40 min，16%～18%A；40～42 min，18%～23%A；42～70 min，23%～40%A；70～90 min，40%～52%A；90～92 min，52%～73%A；92～105 min，73%～80%A；105～115 min，80%～95%A；115～120 min，95%A）；体积流量为1 mL·min-1；进样体积为10 μL；柱温为30 ℃；检测波长为203 nm。

本研究所得混合对照品溶液和供试品溶液的HPLC 图、色谱峰归属及部分色谱峰局部放大图见图1。

图1 开心散混合对照品溶液、供试品溶液的HPLC图及局部放大图

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 按2.4.3 项下的条件精密吸取混合对照品溶液进高效液相色谱仪检测，分析色谱图并指认相应保留时间的色谱峰及对应的峰面积。以质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算回归方程（表1）。由表1可知，8个指标性成分在各自质量浓度范围内线性关系良好。

表1 开心散8个有效成分线性关系考察结果

2.5.2 稳定性试验 取灭菌条件为160 ℃、5 s 的开心散样品1 g，按2.4.1 项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 按2.4.3 项下条件测定远志酮Ⅲ、3,6ʹ-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、茯苓酸、β-细辛醚和α-细辛醚8 个有效成分的峰面积，经计算，其RSD分别为1.97%、0.26%、1.68%、1.67%、1.44%、1.32%、0.06%、1.73%，均小于2%，表明开心散样品在24 h内稳定性较好。

2.5.3 重复性试验 分别取灭菌条件为160 ℃、5 s的开心散散剂6 份，按2.4.1 项下方法制备供试品溶液，按2.4.3 项下条件进样测定，记录色谱峰面积，计算远志酮Ⅲ、3,6ʹ-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、茯苓酸、β-细辛醚和α-细辛醚8 个有效成分的峰面积，计算各成分含量，其RSD 分别为0.48%、1.19%、0.47%、0.13%、0.54%、1.05%、0.16%、0.62%，均小于2%，表明建立的方法重复性较好。

2.5.4 精密度试验 取灭菌条件为160 ℃、5 s 的开心散样品1 g，按2.4.1 项下方法制备供试品溶液，按2.4.3 项下条件连续进样测定6 次，记录峰面积，计算远志酮Ⅲ、3,6ʹ-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、茯苓酸、β-细辛醚和α-细辛醚峰面积的RSD 分别为1.80%、0.31%、0.83%、1.67%、1.38%、0.86%、0.09%、0.93%，均小于2%，表明仪器精密度较好。

2.5.5 加样回收率试验 精密称取已测定8个有效成分含量的灭菌条件为160 ℃、5 s开心散粉末约1 g，平行6 份，分别配置质量浓度约为1 mg·mL-1的远志酮Ⅲ、3,6ʹ-二芥子酰基蔗糖、细叶远志皂苷、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、茯苓酸、β-细辛醚和α-细辛醚对照品溶液，通过倍数稀释后分别精密移取相当于样品中8 个有效成分等剂量的对照品溶液，按照2.4.1项下方法制备供试品溶液，按照2.4.3项下条件进样测定，结果见表2。回收率的RSD 均小于2%，说明该方法准确度较好。

表2 开心散8个有效成分加样回收率考察结果

2.6 灭菌前后开心散有效成分含量测定

准确称取未灭菌开心散及9 个灭菌处理后的开心散样品，按2.4.1 项下方法制备供试品溶液，按2.4.3 项下条件测定8 个指标性成分的色谱峰面积（平行3次），并根据相应的标准曲线计算各自含量。

3 结果与讨论

3.1 微生物限度检测

对灭菌前后的开心散进行微生物限度检测，结果见表3。由表3 可知，灭菌前开心散样品中需氧菌、霉菌和酵母菌严重超标，不符合微生物限度要求，不可以直接作为口服散剂使用。经过高温瞬时灭菌处理后的所有开心散样品均符合《中国药典》2020年版微生物限度项下规定。

表3 不同灭菌条件开心散的微生物限度检测结果

随着灭菌温度的升高、灭菌时间的延长，开心散的灭菌效果越来越好。一般大肠埃希菌、沙门菌、霉菌和酵母菌不耐高温，在70～80 ℃即可杀灭；而需氧菌中存在耐高温的细菌，需升高灭菌温度或延长灭菌时间，才能完全杀灭这些细菌的营养体和芽孢。在160 ℃、5 s的条件下灭菌的开心散样品，需氧菌、霉菌和酵母菌总数均小于《中国药典》2020 年版通则1107 的限度标准，同时大肠埃希菌、沙门菌、耐胆盐革兰阴性菌这3种控制菌在开心散灭菌前后的样品中均未检出。可见，在160 ℃、5 s 的灭菌条件下开心散样品已满足中药散剂的微生物限度要求。

3.2 灭菌前后开心散有效成分含量变化

灭菌前后开心散中8 个有效成分含量变化结果见表4；与未灭菌开心散有效成分含量相比，灭菌开心散样品中8个有效成分含量的变化率见表5。

表4 不同灭菌条件对开心散有效成分质量分数的影响（n=3） %

表5 开心散8个有效成分在不同高温瞬时灭菌条件下与未灭菌样品对比的变化率 %

由表4、表5 可知，开心散在高温瞬时灭菌过程中，有效成分的含量及变化率会随着灭菌温度和灭菌时间变化而变化。高温瞬时灭菌后开心散中的远志酮Ⅲ含量均有所降低，且随着灭菌温度的升高和灭菌时间的增长，其含量越来越低。从结构上分析，远志酮Ⅲ的基本母核由苯环与色原酮的2,3位骈合而成，在高能量条件下糖链断裂，碳苷键会发生交叉环裂解反应，生成裂解产物，可能导致在高温瞬时灭菌条件下含量降低[21-23]。同时，灭菌后开心散中3,6ʹ-二芥子酰基蔗糖的含量除了在170 ℃、9 s时有下降，其他条件均稍有升高。作为寡糖酯类化合物，3,6ʹ-二芥子酰基蔗糖主要以蔗糖为基本母核，以不同的糖苷键连接葡萄糖，少数连接鼠李糖后成为寡糖，寡糖与有机酸类形成酯。3,6ʹ-二芥子酰基蔗糖在较高温条件下不稳定，连接酰基残基上的酯键易发生断裂，分解生成次级产物[24-25]。细叶远志皂苷的含量在9 个灭菌条件下均有所升高，可能是远志中原型皂苷类成分（如远志皂苷B）性质不稳定，因受热糖苷键断裂，发生水解反应，转化成细叶远志皂苷，导致细叶远志皂苷含量上升[26-27]。远志酮Ⅲ、3,6ʹ-二芥子酰基蔗糖和细叶远志皂苷均是远志中安神益智的主要活性成分，具有明显减轻认知障碍和增强学习记忆能力的功效[28]。人参皂苷类成分都具有相似的基本结构，都含有由30 个碳原子排列成4 个环的甾烷类固醇核，属于四环三萜类皂苷成分，灭菌后开心散中人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量均稍高于灭菌前，可能是不同皂苷之间相互转化使两者含量稍有升高，推测是高温灭菌过程中对人参进行了炆制处理，与华国栋等[29]炮制研究结果类似。人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1是人参中的主要活性成分，对治疗神经退行性疾病和神经系统疾病具有较好的药理作用，两者在灭菌过程中含量稍有增加对开心散全方药效发挥有益[30]。β-细辛醚和α-细辛醚均为石菖蒲中挥发油类成分，在高温条件下稳定性较差。由表4、表5可知，灭菌后开心散样品中β-细辛醚和α-细辛醚含量均有降低，且随着灭菌温度的升高和灭菌时间的延长其含量越来越低，但整体变化率未超过5%，可满足灭菌过程有效成分含量变化要求。同时，本研究发现β-细辛醚和α-细辛醚的含量变化存在相反趋势，可能是在此条件下β-细辛醚发生空间结构的重排，部分转化为α-细辛醚。β-细辛醚和α-细辛醚能够快速通过血脑屏障发挥药理作用[31-34]。茯苓酸是茯苓的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、镇静催眠等药理作用，在高温瞬时灭菌后含量略有升高，对开心散全方药效发挥有利[35]。综上，在160 ℃时灭菌5 s，开心散中有效成分含量无明显损失，可满足灭菌工艺要求。

4 结论

灭菌是经典名方开心散制剂生产必不可少的关键操作。本研究根据开心散方中4 味中药的特性和灭菌后样品中有效成分含量变化情况，选择了灭菌效率高、灭菌产品无潮湿结块等优势的高温瞬时灭菌法，最终确定远志、人参、茯苓和石菖蒲粗颗粒为2～8 目、灭菌温度为160 ℃、灭菌时间为5 s 作为开心散最佳灭菌工艺条件。所得开心散灭菌样品符合口服散剂的微生物限度要求，有效成分含量损失少，可为经典名方开心散的灭菌方法研究提供参考。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。