慢性牙周炎患者血清RORA的表达水平及其与Th17/Treg细胞平衡的相关性*

赵雅静 刘淑英 陈晓川 孙天语

(南方医科大学口腔医院牙周病科,广东 广州 510200)

慢性牙周炎(Chronic periodontitis,CP)是由失调的口腔微生物群引起的,是常见的牙齿支持组织炎症性疾病,具有较高的发病率[1]。研究发现,革兰氏阴性菌感染是发生CP的主要原因,T淋巴细胞、巨噬细胞、上皮细胞和促炎细胞因子等与免疫反应有关,其共同作用是牙周炎病原菌的免疫屏障[2]。其中,辅助性T细胞17(T Helper cells 17,Th17)与调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)的比例在正常机体内处于动态平衡,二者失去平衡由一方主导时可能导致炎症反应的发生。在CP发生发展过程中,Th17细胞及其关键细胞因子白细胞介素-17(IL-17)和白细胞介素-23(IL-23)起着关键作用[3],也有学者指出,随着CP病情的加重,Th17/Treg细胞比例依次升高,其可能是CP患者病情评估重要指标[4-5]。维甲酸受体相关孤儿受体A(RAR-related orphan receptor A,RORA)是一种核受体,在调节细胞免疫方面发挥重要作用,并且RORA水平与Treg细胞有关[6]。研究发现,长链非编码RNA TUG1通过调节miR-498/RORA通路参与LPS诱导的牙周炎[7]。研究发现,与正常对照组相比,牙周炎组织中的RORA mRNA和蛋白水平显著下调[8],这提示RORA可能参与牙周炎的发生发展。然而,RORA在CP中发挥何种作用目前仍未可知。免疫系统失衡是CP发生的重要影响因素,因此,本研究通过检测CP患者血清RORA水平,分析RORA与Th17/Treg细胞平衡的关系,以期为CP的发病机制提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年1月—2021年12月于本院进行检查并接受治疗的90例CP患者作为观察组。纳入标准:①符合CP诊断标准[9]。②患者及亲属了解本研究并签署知情同意书。③首次确诊并在我院接受治疗。④至少具有10颗天然牙。排除标准:①精神状态异常,无法正常交流。②在6个月内曾服用抗菌药物。③有吸烟史。④患有免疫相关的疾病。⑤临床信息不完整。另选择同期在本院检查的牙周健康志愿者100例作为对照组。本研究获医院医学伦理委员会审批(批号:201812-0126)。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集 收集两组患者一般资料,包括年龄、性别、体质指数(BMI)及并发高血压、冠心病、糖尿病情况。

1.2.2 血清RORA表达水平的检测 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测CP患者及健康体检者血清中RORA的相对表达水平。采用Trizol试剂(美国Ambion公司)从血清样本中提取总RNA,测定其浓度和纯度,按逆转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)操作步骤逆转录合成cDNA,采用SLAN-96S型qRT-PCR仪(致善生物科技有限公司)进行检测。其中qRT-PCR反应体系共20 μL:cDNA(50 ng/μL)2 μL,2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)10 μL,PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,加ddH2O至20 μL。PCR反应条件:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s;60 ℃,30 s,共40个循环。使用2-ΔΔCt方法(Ct为循环阈值)计算目的基因RORA的相对表达量。RORA正向引物:5′‐CTGACGCCCACCTACAACAT-3′,反向引物:5′-GCCTGATGCTGGTGTGTAGT-3′;内参GAPDH正向引物:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,反向引物:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2.3 Th17、Treg细胞水平的检测 采集CP患者治疗前及健康体检者的晨起空腹静脉血2 mL,加入抗凝剂,3 000 r/min,离心20 min,分离外周血单个核细胞进行体外培养。取两管加入FITC-鼠抗人CD4抗体,然后分别在两试管中加入抗人IL-17A抗体、抗人Foxp3抗体以区分Th17、Treg细胞,按照说明书进行操作,使用流式细胞仪(美国BD FACSCantoII)检测Th17、Treg细胞水平。FITC-鼠抗人CD4抗体(货号:9522-02)购自厦门慧嘉生物科技有限公司,抗人IL-17A抗体(货号:102-P46)购自北京阿斯雷尔生物技术有限公司,抗人Foxp3抗体[货号:Rab(P)13266]购自上海圻明生物科技有限公司。

1.2.4 细胞因子IL-10、IL-17、IL-23及转化生长因子-β(TGF-β)水平的检测 采集CP患者治疗前及健康体检者的晨起空腹静脉血2 mL,室温静置10～20 min后,3 000 r/min,离心20 min,将上清置于无菌EP管中,用于细胞因子IL-10、IL-17、IL-23及TGF-β水平的检测。按照酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒说明书进行操作,利用多功能酶标仪(Thermo公司)测定各样本在450 nm处的吸光度值,依据标准回归曲线计算各组细胞因子的水平。人IL-10(货号:ml064299)、人IL-17(货号:ml058051)、人IL-23(货号:ml058067)、TGF-β(货号:ml064258)试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 观察组:男50例,女40例;年龄22～78岁,平均(46.29±5.47)岁;BMI 20～25 kg/m2,平均(22.53±2.41)kg/m2。对照组:男46例,女54例;年龄20～70岁,平均(47.15±5.85)岁;BMI 19～25 kg/m2,平均(22.06±2.32)kg/m2。两组年龄、性别、BMI及合并高血压、冠心病、糖尿病等一般资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2 两组血清RORA、Th17、Treg及Th17/Treg水平的比较 观察组患者血清中Th17水平明显高于对照组,RORA、Treg水平低于对照组(P<0.05),且Th17/Treg细胞比例高于对照组(P<0.05)。见表2、图1。

图1 两组血清RORA、Th17、Treg及Th17/Treg水平的比较

表2 两组血清RORA、Th17、Treg及Th17/Treg水平的比较

2.3 两组相关细胞因子水平的比较 观察组TGF-β、IL-10水平低于对照组(P<0.05),而IL-17、IL-23水平高于对照组(P<0.05)。见表3、图2。

图2 两组相关细胞因子水平的比较

表3 两组相关细胞因子水平的比较

2.4 CP患者血清RORA与TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23、Th17/Treg的相关性分析 Pearson法分析结果显示,CP患者血清中RORA与TGF-β、IL-10呈正相关(P<0.05),与IL-17、IL-23及Th17/Treg细胞比例呈负相关(P<0.05)。见表4、图3。

图3 CP患者血清RORA与TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23、Th17/Treg的相关性

表4 CP患者血清RORA与TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23、Th17/Treg的相关性

2.5 多因素分析CP发生的影响因素 以是否发生CP为因变量(赋值1=发生,0=未发生),以RORA、TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23、Th17/Treg为自变量,进行多因素Logistic回归分析。结果显示,RORA、TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23及Th17/Treg是CP发生的影响因素(P<0.05)。见表5。

表5 Logistic回归分析CP发生的影响因素

3 讨论

CP口腔感染是由牙齿表面微生物群的失调和宿主失调的炎症反应共同介导,可导致牙周膜和牙槽骨的进行性破坏,并伴有囊袋形成、退缩或两者兼而有之[10-11]。CP还可能增加患恶性肿瘤的风险,严重影响到患者的生命安全[12]。口腔健康可以影响到个人的生活质量。因此,阐明影响CP进展的分子机制尤为重要。免疫细胞在CP疾病中的功能是近年来研究的热点。两个CD4+辅助性T细胞亚群Th17和Treg之间的不平衡被证明在CP的发病机制中具有重要作用[13]。并且,研究发现RORA参与CP的发生发展[14]。基于此,本研究重点关注CP患者血清中RORA的表达水平与Th17/Treg细胞平衡的相关性,探寻CP在早期筛查中的潜在标志物。

RORA属于核激素受体超家族,作为一种广泛表达的转录因子可参与调节脂质和类固醇代谢、免疫反应和昼夜节律等[15]。郑雪晴等[16]研究发现,RORA在口腔鳞状细胞癌组织中低表达,过表达RORA可抑制裸鼠移植瘤的生长速度及肿瘤体积。RORA在胶质母细胞瘤中低表达,RORA高表达患者生存率高[17]。由此可见,RORA作为肿瘤抑制基因在癌症中发挥作用。本研究首先对CP患者与健康体检者的一般临床资料进行比较,结果发现,两组研究对象的年龄、性别、BMI及并发高血压、冠心病、糖尿病等指标均无统计学差异,证明临床数据具有可比性。Wang等[18]研究发现,与正常人群相比,牙周炎患者RORA表达明显下调,本研究结果与其一致,这提示RORA可能参与CP的病理过程,RORA可能是CP患者潜在的血清学标志物。

CD4+辅助性T细胞在激活后分化为调节性和效应性T细胞亚群,即Th1、Th2、Th17、滤泡辅助性T细胞和Tregs细胞。其中Th17细胞和Treg细胞因在机体内履行不同的功能而被广泛关注。Th17细胞产生IL-17、IL-22和IL-23等促炎因子,募集中性粒细胞,并促进感染部位的炎症,Treg细胞产生抗炎细胞因子IL-10和TGF-β,抑制多种免疫细胞的活性,从而抑制免疫反应[19-20]。Liu等[21]研究发现,肠道黏膜中Th17/Treg比例失衡可增加结肠炎症发生的风险。司秀影等[22]研究发现,Th17/Treg细胞失衡可影响哮喘的发生发展。Th17/Treg细胞在多种疾病中发挥重要的免疫作用。也有学者发现,牙周炎患者血清和牙龈组织中Th17细胞的数量比Treg细胞增加的更显著,Th17/Treg细胞比例发生失衡[23]。本研究结果发现,与对照组相比,观察组Th17水平升高,Treg水平降低,Th17/Treg细胞比例增加(P<0.05)。这提示CP患者体内存在Th17/Treg细胞比例失衡的现象,Th17/Treg失衡是向Th17转化,使Th17表达更有优势。于淑琪等[24]研究发现,CP患者Th17/Treg细胞比例高于健康对照组,这提示Th17/Treg失衡可能影响CP发生发展,本研究结果与其相符,值得进一步探索。

IL-10和IL-17是调节Th17/Treg平衡的关键细胞因子,正常情况下,Th17、Treg细胞比例在机体内处于动态平衡,若Th17/Treg细胞的平衡状态被打破,偏向于其中一方时,将导致机体炎症反应及免疫功能发生异常[25]。本研究结果发现,与对照组相比,观察组TGF-β、IL-10水平明显降低,而IL-17、IL-23水平明显升高,这进一步证明CP病理过程与Th17/Treg细胞比例有关,提示CP的发生发展与炎症反应及免疫功能异常有关。研究发现,IL-35可以通过RORα和RORγ t可直接抑制IL-23的表达,从而抑制牙周炎等炎症性疾病中的过度免疫反应[11]。上述实验结果表明RORA、Th17/Treg细胞均可参与CP的发生发展,那么RORA能否通过调控Th17/Treg细胞的水平从而影响CP的进程呢?本研究结果显示,CP患者血清中RORA与TGF-β、IL-10呈正相关,与IL-17、IL-23及Th17/Treg细胞比例呈负相关,这提示RORA可能通过影响Th17/Treg细胞失衡、TGF-β、IL-10水平下调及IL-17、IL-23水平上调,来促进炎症反应的发生,进而促进CP的发生。进一步分析发现,RORA、TGF-β、IL-10、IL-17、IL-23及Th17/Treg是CP发生的影响因素。这提示RORA水平降低和Th17/Treg细胞比例的失衡可加大CP发生的风险,RORA可能通过调节Th17/Treg细胞比例影响CP的进程。并且,该结果提示RORA、IL-10、IL-17、IL-23及TGF-β可能是CP早期筛查的潜在指标。

4 结论

CP患者血清中RORA低表达,Th17/Treg细胞比例失衡,RORA的表达与Th17/Treg细胞比例之间呈负相关,RORA可能通过影响Th17/Treg细胞平衡,促进炎症反应和CP疾病的发生。但二者具体影响机制还需进行大量实验予以验证。