电针调控瞬时受体电位TRPV1表达与急性痛风性关节炎大鼠疼痛的关系*

李赟 张如峰 吴文英

(西宁市第一人民医院风湿免疫血液科,青海 西宁 810000)

痛风疼痛是最严重的疼痛症状之一,会严重影响患者的生活质量[1]。因此,开发减轻痛风疼痛的有效止痛方法具有重要的临床意义。当前减轻痛风疼痛的治疗方法仍限于秋水仙碱、非甾体抗炎药和皮质类固醇。然而,使用这些药物常常会导致严重的不良反应,例如胃肠道不良反应、慢性肾功能不全、烦躁不安和免疫抑制[2-3]。电针(Electroacupuncture,EA)是一种将传统针灸和现代电疗相结合的技术,它可以在许多急性和慢性疼痛条件下产生令人满意的镇痛作用,并且几乎没有副作用[4]。动物研究表明,EA在多种炎症性疼痛模型中均能抑制疼痛反应,包括完全弗氏佐剂引起的炎症性疼痛,胶原蛋白引起的类风湿性关节炎疼痛,皮肤切开后疼痛和纤维肌痛[5-6]。在临床上,据报道EA可以改善急性痛风性关节炎患者的视觉模拟量表评分[7]。然而,直到现在,尚不清楚EA在减轻急性痛风性关节炎动物模型中疼痛反应的潜在机制。香草酸(TRPV)是瞬时受体电位(TRP)家族的六个跨膜结构域之一,其中香草酸亚型1(TRPV1)是周围感觉神经元的伤害感受器,可以识别来自周围神经末梢的感觉输入,并在尿酸单钠盐诱导的伤害感受和炎症中起相关作用,表明它是治疗急性痛风发作的潜在靶点[8]。因此,本研究通过将尿酸钠注射至踝关节建立急性痛风性关节炎大鼠模型,观察EA治疗是否有助于降低该模型的疼痛反应以及对外周背根神经节与中枢脊髓背角中TRPV1及其相关下游分子表达情况的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 使用SPF级雄性SD大鼠60只,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司(合格证编号:SCXK 2016-0005),体重180～240 g。在可控温度和光/暗周期为12 h的环境下,每只笼子饲养6只大鼠。自由摄取食物和水。本研究涉及的动物实验方案经本院伦理委员会批准同意(伦理号:2019025)。

1.2 材料与仪器 尿酸钠购自美国Sigma-alorich公司;蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液购自美国Amresco公司;抗TRPV1购自以色列Alomone公司;S100B、GFAP、RAGE购自美国Millipore公司;辣根过氧化物酶偶联的二抗购自美国Santa Cruz Biotechnology公司;ECL Western印迹检测试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司。LH-202H韩氏穴位神经刺激仪购自河北润连机械设备有限公司;von Frey细丝购自意大利UGO Basile公司;37450动态足底触觉仪购自意大利Ugo Basile公司;Quantity One软件购自美国Bio-Rad实验室。

1.3 方法

1.3.1 急性痛风性关节炎大鼠模型建立 60只大鼠分为4组,即对照组、模型组(尿酸钠诱导的急性痛风性关节炎大鼠模型)、假EA治疗组(Sham EA,尿酸钠诱导的急性痛风性关节炎大鼠模型+假性EA治疗)和EA治疗组(尿酸钠诱导的急性痛风性关节炎大鼠模型+EA治疗),每组15只。将尿酸钠悬浮在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在手术前,先用70%的酒精对脚踝区域进行消毒。对照组接受50 μL PBS注射。进行小切口后,通过一根21号针头将1.25 mg尿酸钠(50 μL)注射到大鼠踝关节中,该针头恰好位于胫骨前肌腱的内侧,其尖端倾斜成45°。注射后4～6 h,观察到明显的踝关节肿胀和机械痛觉过敏视为痛风性关节炎模型成功建立。模型组、假EA治疗组和EA治疗组所有大鼠均成功建立急性痛风性关节炎模型。

1.3.2 EA治疗 EA治疗组分别在模型建立后第8、24和48 h进行EA治疗。具体操作为:将大鼠松散固定,将四根直径0.25 mm的不锈钢灸针以5 mm的深度插入双侧足三里(ST36,胫骨前小结外侧5 mm)和昆仑(BL60,在踝关节水平、外踝尖和跟骨之间)穴位。针头与LH-202H韩氏穴位神经刺激仪(河北润连机械设备有限公司)连接。输出2/100Hz疏密波(2Hz刺激的脉冲宽度:0.6 ms,100Hz刺激的脉冲宽度:0.2 ms,每种频率持续3 s)和强度范围为1～2 mA(开始时为1 mA持续15 min,然后切换为2 mA持续15 min),每次治疗30 min。对于假EA治疗组,将针头皮下插入ST36和BL60,但没有放电。

1.3.3 踝关节水肿的测定 水肿是通过数字卡尺测量的踝关节直径增加而观察到的,其计算公式为基础值与测试值之间的差异(在关节内注射尿酸钠或PBS后的不同时间点观察结果)。

1.3.4 持续疼痛评分评估 将大鼠分别置于透明的有机玻璃室中并适应30 min,然后每只大鼠观察5 min。在玻璃室中,以45°角放置一面镜子,观察大鼠的脚。根据以下等级评估并分类大鼠愿意放在注射肢体后爪上的重量(爪压):0=正常爪压,两个后爪相等的重量;1=爪子压力轻微降低(脚掌完全在地板上,但脚趾没有散开);2=足爪压力适度降低(脚卷曲,仅脚的某些部分轻轻接触地面);3=爪子压力严重降低(脚完全抬起)。

1.3.5 机械性疼痛测定 将大鼠分别置于高架网地板上的透明有机玻璃室内,并在测试前使其适应30 min。机械性痛觉超敏症是通过一系列经校准的von Frey细丝(意大利UGO Basile公司)垂直于后爪的足底中部表面施加足够的力,使细丝轻微弯曲3～5 s来确定。爪子突然缩回、舔以及对刺激的强烈震动被认为是疼痛样反应。通过非参数Dixon测试计算出50%的爪退缩阈(PWT)。在正式测试之前,连续3 d每天进行PWT的基线测试,以使大鼠适应环境并确保各组之间没有差异。

1.3.6 热痛觉过敏的测定 使用37450动态足底触觉仪(意大利Ugo Basile公司)评估对热刺激(热痛觉过敏)的超敏反应。在测试前使大鼠适应30 min。将灯泡产生的辐射光束导入右后爪,以确定爪缩回潜伏期(从刺激中移出爪所需的时间)。设置20 s的截止阈值,以避免过热导致伤害。爪缩回潜伏期的明显减少认为热痛觉过敏。

1.3.7 踝关节的组织病理学评价 在注射尿酸钠后8 h处死大鼠,解剖踝关节,去除关节周围组织。将踝关节固定在10%福尔马林中,并使用10% EDTA脱钙。然后通过在不同等级的乙醇/氯仿混合物中进行处理将其脱水,并包埋在石蜡中。将切片切成6 μm的厚度,并用苏木精和曙红染色以在光学显微镜下进行病理检查。

1.3.8 免疫印迹(Western blot)测定 在完成动物行为测试后,立即切除大鼠外周背根神经节与中枢脊髓背角以提取蛋白质。通过在含有50 mM Tris-HCl pH 7.4、250 mM NaCl,1%NP-40、5 mM EDTA,50 mM NaF,1 mM Na3VO4、0.02%NaN3和1x蛋白酶抑制剂混合物的裂解缓冲液(美国Amresco公司)中匀浆组织来制备总蛋白。将提取的蛋白质通过8%SDS-Tris甘氨酸凝胶电泳,然后转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶在TBS-T缓冲液(10 mM Tris pH 7.5,100 mM NaCl,0.1%Tween 20)中封闭膜,并与抗TRPV1(～95 kDa,1∶1 000,以色列Alomone公司),S100B(～51 kDa,1∶1 000,美国Millipore公司),GFAP(～125 kDa,1:1 000,美国Millipore公司),RAGE(～80-82 kDa,1∶1 000,美国Millipore公司)在室温下孵育过夜。在室温下用适当的辣根过氧化物酶偶联的二抗(1∶5 000;美国Santa Cruz Biotechnology公司)覆盖2 h。用ECL Western印迹检测试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司)对蛋白条带进行可视化。使用Quantity One软件(美国Bio-Rad实验室)对条带密度进行定量。

2 结果

2.1 尿酸钠诱导大鼠急性痛风性关节炎模型的建立及镇痛性能的评价 与对照组相比,模型组大鼠的踝关节在尿酸钠注射后2 h时表现出广泛的肿胀,并在8 h时达到峰值,持续到注射后48 h,在注射后72 h,踝关节肿胀完全消失(图1A)。在注射尿酸钠后8 h,显微镜观察踝关节滑膜组织学切片显示,模型组大鼠炎症细胞广泛浸润,并伴有局灶性滑膜增生(图1B)。模型组大鼠表现出明显的持续性疼痛行为,这些行为持续到尿酸钠注射后48 h(图1C)。模型组大鼠表现出明显而持久的机械性超敏反应,在尿酸钠注射后2 h达到峰值,并持续到48 h(图1D)。此外,模型组大鼠表现出轻度的热超敏反应,该反应在尿酸钠注射后4 h出现并持续到24 h(图1E)。上述数据表明,该大鼠痛风模型概括了人类急性痛风发作的疼痛反应。因此,以下实验利用该模型并在尿酸钠注射后0～48 h之间进行,以研究EA是否以及如何减轻急性痛风性关节炎的疼痛反应。

图1 大鼠急性痛风关节炎模型的建立以及疼痛的表征

2.2 EA对尿酸钠所致痛风大鼠疼痛反应的影响 与之前一样,将尿酸钠注射到大鼠脚踝导致持续疼痛评分明显升高,以及50% PWT和爪退缩潜伏期明显减少。与假EA组相比,在8、24和48 h时间点,EA治疗显著降低了痛风大鼠的持续疼痛评分(P<0.05),同时显著增加了50% PWT和爪退缩潜伏期(P<0.05)。以上结果表明,EA治疗有效缓解了尿酸钠诱发的急性痛风性关节炎的持续疼痛,并产生稳定而持久的抗痛觉过敏和抗热痛觉过敏。见图2。

图2 EA对尿酸钠所致痛风大鼠疼痛反应的影响

2.3 EA对TRPV1和相关下游分子的蛋白水平表达影响 使用Western blot分析来确定EA治疗是否可以改变痛风大鼠疼痛反应相关的TRPV1及其下游分子的蛋白表达水平。结果表明,无论在背根神经节与中枢脊髓背角,与对照组相比,模型组TRPV1和相关的下游蛋白激酶(S100B、GFAP和RAGE)水平表达均显著提高(P<0.05)。EA治疗显著降低了TRPV1和相关的下游蛋白激酶(S100B、GFAP和RAGE)的过表达(P<0.05),而假EA治疗并没有改变这一观察结果。见图3。

图3 EA对TRPV1和相关下游分子的蛋白水平表达影响

3 讨论

尿酸钠在关节内和关节周围沉积会引起白细胞浸润,从而吞噬尿酸钠。该过程将产生炎性和伤害感受介质[9-12]。这些介体(例如IL-1β和过氧化氢)可致敏或直接激活周围感觉神经系统中的伤害感受器,并引起剧烈疼痛[13]。本研究通过将尿酸钠注射到大鼠的踝关节中,建立了急性痛风性关节炎大鼠模型。该模型是用于研究痛风的疼痛反应和炎症机制的常用动物模型。结果发现,在尿酸钠注射后2～4 h,大鼠出现了强烈的踝关节肿胀和疼痛反应。在注射后8 h时,肿胀和疼痛反应达到高峰。踝关节滑膜组织显示炎症细胞广泛浸润和增生。这些迹象均与使用相同模型的其他研究一致,表明成功建立痛风模型[14]。但是与其他研究不同,本研究进一步延长了观察时间,发现踝关节在尿酸钠注射后48 h仍然表现出明显的疼痛迹象,此后逐渐消退[15]。因此,本研究选择在8～48 h的时间窗内检查了EA的镇痛作用。

先前研究比较了低频(2 Hz)、高频(100 Hz)和混合频率(2/100 Hz)EA对急性痛风性关节炎的镇痛作用,发现低频(2 Hz)EA无效,高频(100 Hz)与混合频率(2/100 Hz)EA的镇痛效果相似,但高频(100 Hz)EA治疗与混合频率(2/100 Hz)EA治疗相比,前者未能产生稳定而持久的抗痛觉过敏,表明通过重复使用100 Hz EA可能产生镇痛耐受性[16]。还有研究报道了在弗氏完全佐剂诱发的炎症性疼痛大鼠模型中,2/100 Hz或100 Hz EA会持续产生抗伤害感受,而10 Hz EA则完全无效[17]。基于上述数据,本研究认为2/100 Hz是减轻尿酸钠诱发的急性痛风性关节炎疼痛反应的最佳EA频率。因此,本研究在实验中采用了2/100 Hz频率进行EA治疗,结果发现EA对急性痛风性关节炎大鼠模型的机械性痛觉过敏产生了良好的镇痛效果,同时还可以显著减轻模型大鼠的持续疼痛评分、热痛觉过敏和踝关节肿胀。

已有研究显示TRPV1参与多种疼痛性炎症,包括急性痛风性关节炎[18-20]。在急性痛风发作中,通常伴随着难以忍受的灼痛。TRPV1在有害热的检测中似乎很重要,因为TRPV1激动剂会诱发(而TRPV1拮抗剂会逆转)人类的灼痛。TRPV1的激活可以进一步启动Ca2+内流,使神经元去极化[20]。TRPV1功能的下调导致对高温刺激,辐射热和热板测试不敏感[21]。炎性介质可诱导痛觉过敏激活TRPV1,提示其在炎性疼痛中的重要作用[14]。在炎性疼痛模型中,注射TRPV1拮抗剂卡西平可减轻热痛觉过敏[22]。本研究发现,注射尿酸钠后模型组大鼠在背根神经节与中枢脊髓背角中TRPV1的表达和相关的信号通路增加;EA处理可进一步降低TRPV1过表达,表明EA对急性痛风性关节炎疼痛有抵抗力。Wu等[23]研究表明ST36的解剖层,尤其是肌肉层中有大量的TRPV1。免疫荧光数据还显示,TRPV1在ST36穴位神经和非神经细胞中表达。向ST36穴位注射辣椒素(TRPV1激动剂)可以像手动针灸治疗一样有效地缓解炎性疼痛,复制针灸的镇痛作用。Zhang等[24]指出,在ST36穴位的EA可以通过减轻荷瘤大鼠背根神经节中TRPV1的mRNA和蛋白水平的表达来减轻癌症引起的疼痛。Chen等[25]报道,在双侧ST36、BL60穴位处的EA可以减少因向踝关节内注射尿酸钠引起的机械和热痛觉过敏;TRPV1在炎症性疼痛中增加,并且可以通过在周围背根神经节处的EA刺激进一步减弱。这些结果不仅表明EA可以缓解疼痛,还表明EA可以减少小到大直径神经元中TRPV1的过表达。此外,本研究还发现TRPV1的激活会增加S100B、GFAP和RAGE的表达,而EA治疗可以减少GFAP、S100B和RAGE的过表达,从而减轻疼痛。

4 结论

EA在急性痛风性关节炎大鼠模型中可有效缓解疼痛反应,其主要通过TRPV1及其下游蛋白激酶S100B、GFAP和RAGE受体介导镇痛作用,为实践EA治疗急性痛风性关节炎疼痛的临床应用提供了重要证据。