安徽省临泉县羊场常用饲料及饲料原料霉菌毒素污染的调查分析

张孟恩，梁 锐，韩 睿，赵国宏，庞训胜，辛洪雷，李文涛，王世琴

（1.安徽科技学院动物科学学院，安徽 凤阳 233100；2.动物营养调控与健康安徽省重点实验室，安徽 凤阳 233100；3.临泉县中原牧业发展中心，安徽 临泉 236400）

目前，检测AFB1、ZEN 和DON 的方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法和荧光定量检测法等，高效液相色谱法和气相色谱法因其需要相关的仪器才能完成检测过程，酶联免疫吸附法操作过程繁琐，在生产实践中应用有很大的限制。 胶体金免疫层析技术既能够对食品中的各种农兽药化学残留和微生物及其他真菌毒素等进行检测，还能够快速地诊断各种动物流感性疾病，具有较广的检测范围［9-10］。荧光定量检测应用量子点免疫层析技术， 以条状纤维层析材料为固相， 通过毛细作用使样品溶液到达指定位置反应，通常与免疫层析法结合使用。霉菌毒素荧光定量检测技术基于免疫层析和特异性免疫反应， 针对检测项目遴选高特异性的单克隆抗体，依托先进的荧光量子点微球标记技术，在层析作用完成特异性结合，并激发荧光强度，通过专用的荧光设备测量检测线和质控线的荧光强度值，结合内置的标准曲线完成检测过程［11］。相较于传统的胶体金检测技术， 荧光定量检测具备灵敏度高、数字稳定等优势，同时检测时间短、定量精准、操作便捷、多种荧光标记物可供选择等优点，是目前的研究热点，广泛应用于粮食、饲料、油脂和面粉等行业。 为调查分析临泉县饲料及饲料原料霉菌毒素污染情况， 本研究利用荧光定量检测法测定临泉县羊场常用饲料及饲料原料中AFB1、ZEN、DON 污染情况，以期为羊场饲料及饲料原料的保存和管理提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

2022 年3—8 月从安徽省临泉县存栏数在500 只以上的规模化羊场采集饲料及饲料原料，按照我国国家推荐标准 《饲料 采样》（GB/T 14699—2023）［12］制备样品。饲料粉碎过40 目标准筛，置于自封袋中，于-20 ℃保存备用。饲料样品共55 份，主要包括豆粕、小麦及麦麸、玉米、大豆皮、羔羊精料补充料、肉羊精料补充料、育肥羊全价配合饲料以及羊场自配饲料。

1.1.2 主要试剂

AFB1、ZEN、DON 检测试剂盒购自天津龙科新域生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器设备

FZ102 型饲料粉碎机， 上海科恒实业发展有限公司产品；SN-LSC-40S 型离心机， 上海尚普仪器设备有限公司产品；XH-B 型涡轮振荡器，江苏天翎仪器有限公司产品；LKXY0039 型恒温孵育器、LKFY2201379 型荧光读数仪，天津龙科新域生物技术有限公司产品。

由表2可知:AW0工况下，向下最大动挠度值为8.5 mm；AW3工况下，向上最大动挠度值为8.0 mm，两者较为接近。因为由轨道病害引起的轮轨垂向冲击力主要由簧下质量决定，故由冲击力引起的位移变化与车辆状态AW0/AW3关系不大。

1.2 试验方法

1.2.1 饲料样品中AFB1、ZEN 及DON 含量的测定

按照试剂盒说明书测定饲料样品中AFB1、ZEN 及DON 含量，其主要步骤如下。

①准备工作，提前预热孵育器，配制50%乙醇。

②称量5 g 样品， 称量40 mL 50%乙醇水，加入50 mL 试管中，并充分振荡5 min。

③溶液静置后取50 μL 上清液到2 mL 离心管中， 并移取450 μL 稀释液到2 mL 离心管中，再将离心管对称放入离心机中4 000 r/min 离心5 min。

④将微孔条放置孵育器载架微孔中， 吸取离心后上清液200 μL 加入微孔中。 将装好试剂条的三联检测卡放到孵育器载架上， 加热5 min后使用移液器吹打混匀微孔溶液30 s， 然后静置3 min。

⑤将孵育器载架盖合并进行加热， 准确计时5 min 后将检测卡取出，插入荧光读数仪1 min 内判读结果并记录。

1.2.2 检出限度

AFB1：检测范围1～50μg/kg，最低检出限1 μg/kg。ZEN：检测范围10～1000μg/kg，最低检出限10μg/kg。DON： 检测范围100～8 000 μg/kg， 最低检出限100 μg/kg。

1.2.3 判定标准

检测完成后，依照国家标准《饲料卫生标准》（GB 13078—2017）［13］对 饲 料 及 饲 料 原 料 中 的AFB1、ZEN、DON 含量进行判定， 并计算检出率和超标率。

2 结果与分析

2.1 临泉县羊场黄曲霉毒素B1 污染情况

饲料原料及全价配合饲料中AFB1检测结果见表1。 由表1 可知，玉米、羔羊精料补充料、肉羊精料补充料、育肥羊全价配合饲料、羊场自配饲料AFB1检出率分别为30.00%、69.23%、75.00%、42.86%、57.14%，豆粕、大豆皮和小麦及麦麸均未检出；羔羊精料补充料、肉羊精料补充料的超标率为15.38%和12.50%，其他样品均未超标；玉米、羔羊精料补充料、肉羊精料补充料、育肥羊全价配合饲料、 羊场自配饲料的检出最大值分别为53.5、28.9、38.3、16.9、26.7 μg/kg。 肉羊精料补充料检出率最高，羔羊精料补充料超标率最高，玉米检出值最大。

表1 饲料原料及全价配合饲料中AFB1 检测结果

2.2 临泉县羊场玉米赤霉烯酮污染情况

饲料原料及全价配合饲料中ZEN 检测结果见表2。 由表2 可知，小麦及麦麸、玉米、羔羊精料补充料、肉羊精料补充料、育肥羊全价配合饲料、羊场自配饲料ZEN 检出率分别为33.33%、50.00%、76.92%、62.50%、71.43%、57.14%，豆粕和大豆皮均未检出；小麦及麦麸、羔羊精料补充料、肉羊精料补充料的超标率为16.67%、7.69%、12.50%，其他样品均未超标；小麦及麦麸、玉米、羔羊精料补充料、肉羊精料补充料、育肥羊全价配合饲料和羊场自配饲料的检出最大值分别为1 100、110、650、1 120、260 和300 μg/kg。 羔羊精料补充料检出率最高，小麦及麦麸超标率最高，肉羊精料补充料检出值最大。

表2 饲料原料及全价配合饲料中ZEN 检测结果

2.3 临泉县羊场呕吐毒素污染情况

饲料原料及全价配合饲料中DON 检测结果见表3。 由表3 可知，小麦及麦麸、玉米、羔羊精料补充料、肉羊精料补充料、育肥羊全价配合饲料和羊场自配饲料DON 检出率分别为83.33%、90.00%、69.23%、75.00%、71.43%和57.14%， 豆粕和大豆皮均未检出； 羔羊精料补充料的超标率为23.08%，其他的样品均未超标；小麦及麦麸、玉米、羔羊精料补充料、肉羊精料补充料、育肥羊全价配合饲料和羊场自配饲料的检出最大值分别为2 160、1 750、2 780、2 950、1 510 和1 070 μg/kg。玉米检出率最高，羔羊精料补充料超标率最高，肉羊精料补充料检出值最大。

表3 饲料原料及全价配合饲料中DON 检测结果

2.4 临泉县羊场饲料及饲料原料中霉菌毒素污染总体情况

饲料及饲料原料中霉菌毒素污染总体情况见表4。 由表4 可知，饲料及饲料原料中AFB1、ZEN、DON 的检出率分别为50.90%、56.36%和69.09%，超标率分别为7.27%、5.45%和5.45%。 对临泉县采集的55 份饲料及饲料原料样品进行了165 次检测， 其中97 次检测结果呈阳性， 阳性率高达58.79%。 在55 份样品中，3 种霉菌毒素均未检出的样品占比10.91%（6 份），1 种霉菌毒素阳性检出率为27.27%（15 份），2 种霉菌毒素阳性检出率为30.91%（17 份），3 种霉菌毒素阳性检出率为30.91%（17 份）。

表4 饲料及饲料原料中霉菌毒素污染总体情况

3 讨论

3.1 临泉县羊场黄曲霉毒素B1 污染状况分析

霉菌毒素是由霉菌或真菌产生的有毒次级代谢产物，广泛存在于饲料原料中。 据联合国粮农组织（FAO）报告，世界上约有25%以上的谷物不同程度被霉菌毒素污染，每年谷物、水果和油籽作物的霉菌毒素污染在全球范围内已造成数十亿美元的损失［14］。 在本研究中，玉米、羔羊精料补充料、 肉羊精料补充料的最高检测值分别为53.5、28.9、38.3 μg/kg，与张勇等［15］的调查结果类似， 可能是饲料中含有较高的营养物质水平，更利于霉菌毒素的生长繁殖。 豆粕、大豆皮和小麦及小麦麸中均未检出AFB1，这与雷元培等［16］研究结果不同， 可能是饲料样品和地区不同导致的。玉米中AFB1检出率为30%， 最大检出值为53.5 μg/kg， 可能因为玉米中含有丰富的营养成分，为微生物代谢提供良好的条件，使霉菌容易生长并产生毒素。 羔羊精料补充料、肉羊精料补充料的检出率高达69.23%和75.00%， 超标率高达15.38%和12.50%，污染最为严重，这与丁燕玲等［17］的研究结果类似，全价饲料因为组成的复杂性和保存管理手段有限，其霉菌毒素污染更为严重。育肥羊全价配合饲料和羊场自配饲料的检出率分别为42.86%和57.14%，与孙蓓等［18］的结果相似，因为配合饲料和羊场自配饲料相较于其他单一饲料含有更多的原料， 也进一步增加了霉菌毒素污染的概率，虽然有较高的AFB1检出率，但是含量仍小于饲料卫生标准， 饲料质量仍在安全范围内。 由于AFB1的检出下限较低，很容易产生超标现象，因此养殖场要及时注意AFB1含量变化。

3.2 临泉县羊场玉米赤霉烯酮污染状况分析

饲料及原料中ZEN 检测结果表明，豆粕和大豆皮中未检出玉米赤霉烯酮， 表明这两种饲料原料储存较好未受到玉米赤霉烯酮污染。 据2019—2020 年和2021 年中国饲料霉菌毒素污染调查报告结果显示，玉米、小麦及麦麸和全价配合饲料的检出率和超标率呈逐年上升趋势［15，19］。 张丞等［20］研究发现，玉米ZEN 阳性检出率为72.7%，小麦及麦麸和全价配合饲料的检出率分别为20.8%和85.3%，本试验中玉米、小麦及麦麸和育肥羊全价配合饲料的检出率高达50.00% 、33.33% 和71.43%， 试验结果与前人研究结果相似， 说明玉米、 小麦及麦麸和育肥羊全价配合饲料更易受到ZEN 污染。羔羊精料补充料、肉羊精料补充料和羊场自配饲料也存在不同程度的污染和超标问题，因为该种类原料流通环节较多，加工、运输过程会增加霉菌毒素污染概率。

3.3 临泉县羊场呕吐毒素污染状况分析

饲料及原料中DON 检测结果表明，豆粕和大豆皮中未检出，说明这两种饲料原料安全性较高，与朱风华等［21］的检测结果相同。 小麦及麦麸和玉米的DON 检出率均超过80%， 是DON 污染最严重的饲料原料，但未超标，与夏骏等［22］报道的结果相一致。配合饲料中含有多种饲料原料，因此其受霉菌毒素污染更为普遍。 羔羊精料补充料的检出率为69.23%，超标率为23.08%，可能是饲料通常大批量堆放在一起，储存条件差，羔羊精料补充料每次用量较小，通风散热不良，饲料仓库潮湿，地面物料先发霉从而污染饲料等因素而引发霉变［23］。肉羊精料补充料、育肥羊全价配合饲料和羊场自配饲料检出率为75.00%、71.43%和57.14%，说明羊场配合饲料存在受霉菌毒素污染情况。 由于饲料有多种单一的饲料原料混合而成造成饲料中霉菌毒素阳性检出率高于饲料原料， 这与王国强［24］研究结果相似。

3.4 临泉县羊场饲料及饲料原料中霉菌毒素污染总体状况分析

综合以上结果，饲料及饲料原料中检出率最高的毒素是DON，其次是ZEN，最低是AFB1。 AFB1超标率最高，污染最严重，这与朱风华等［21］调查分析饲料霉菌毒素污染的检出结果相同。研究显示，我国北方区域饲用玉米AFB1检出率为91.4%，平均值为10.5 μg/kg，最大值为200.1 μg/kg，超标率为2.8%［25］。 本试验结果显示，饲料及饲料原料中AFB1平均检出率高达50.90%， 超标率为7.27%，阳性平均值为36.6 μg/kg，最大值为53.5 μg/kg，超标率和均值高于前人研究结果， 可能是地理条件和气候环境导致结果差异。Gruber-Dorninger 等［26］分析了从100 个国家收集的74 821 份样品中霉菌毒素的污染情况，发现在15 860 份玉米样品中，ZEN 的污染率为44%，最高值可达16 495 μg/kg。在本研究中，饲料及饲料原料中的ZEN 检出率为56.36%，超标率5.45%，阳性均值为850 μg/kg，最大值1 120 μg/kg，结果与前人研究相似。 雷元培等［16］报道，小麦及小麦麸的DON 污染率最高，本研究结果显示， 饲料及饲料原料中DON 检出率为69.09%，最大值高达2 950 μg/kg，说明饲料及饲料原料受DON 污染风险较高，与上述研究结果相似。

4 结论

安徽省临泉县规模化羊场部分饲料及饲料原料中AFB1、ZEN、DON 检出率较高，且部分饲料及饲料原料中AFB1、ZEN 和DON 的含量超过了我国饲料卫生标准。 综合检出率和超标率来看，玉米、小麦及麦麸、羔羊精料补充料、肉羊精料补充料中3 种霉菌毒素的污染问题比较突出。 该地区羊场饲料及饲料原料中霉菌毒素污染形势较严峻，霉菌毒素污染的防控工作仍需进一步加强。