医疗机构制剂补肾生精片质量标准提升研究

陈宗文 陈燕颜 卢伟宁 江洪亮

广东省高州市中医院制剂科，广东高州 525200

补肾生精片为潘茂名弟子传承下来的医疗机构制剂注册品种（批准文号：粤药制字Z05170158），具有超过20年的临床应用历史。本品具补肾壮阳，生精之功效，用于男子精子数少、活动力或活动率差、死精等，已经为广大不育男性患者带来福音，值得进一步完善其理论体系及市场化开发利用。原该制剂的注册标准只有黄芪、山茱萸的薄层鉴别以及山药的显微鉴别，已经不能满足本品市场化的需求及质量标准提高的要求。本研究参照《制剂质量研究及标准制定指导原则》，对该注册制剂品种质量标准提升进行研究，为本品市场化及实际生产提供实验依据及质量控制标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器与材料

JJ124BF型电子分析天平（常熟市双杰测试仪器厂）；SB25-12DTD超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；RIGOL L-3000型高效液相色谱仪（北京普源精电科技有限公司）；Rigol Compass C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；WFH-201BJ型紫外可见透射反射仪（上海精科实业有限公司）；薄层层析用硅胶G、硅胶GF254（青岛海洋化工厂分厂）。

1.2 试药与试剂

补肾生精片（批号：20210812、20210908、20211006）及各阴性样品均由高州市中医院制剂室提供；淫羊藿苷（批号：110737-201516）、熟地黄对照药材（批号：121196-201406）、巴戟天对照药材（批号：121163-201405）均购于中国药品生物制品检定所；试剂：流动相为色谱纯，其余为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 淫羊藿[1-2]取本品细粉6 g，加70%乙醇溶液50 ml，玻璃棒搅拌下溶解，超声30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加入30 ml热水，玻璃棒搅拌下溶解，置分液漏斗以水饱和正丁醇振荡提取3次，30 ml/次，合并正丁醇液，再以氨水振荡洗涤3次，30 ml/次，下层浓氨试液弃去，上层正丁醇液置蒸发皿中蒸干，残渣加入2 ml乙醇使溶解，制成淫羊藿供试品溶液。再称取缺淫羊藿阴性样品细粉6 g，自“置三角烧瓶中，加70%乙醇溶液50 ml，玻璃棒搅拌下溶解，超声30 min”起制成阴性对照溶液。另取淫羊藿苷适量，加甲醇定容并超声溶解，制成0.135 mg/ml对照品溶液。按薄层层析法，于同一硅胶G薄层板上分别点样对照品、供试品及阴性对照溶液8、1、1 μl，以乙酸乙酯∶丁酮∶甲酸∶水=8∶1∶1∶1预饱和15 min，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点清晰，365 nm荧光下检视。相比对照品色谱，供试品显相同的绿色或黄绿色荧光斑点，且阴性对照无干扰斑点。见图1。

图1 淫羊藿薄层色谱图（紫外365 nm）

2.1.2 盐巴戟天[3-4]取本品细粉6g，置三角烧瓶中，加入乙醇50 ml，玻璃棒搅拌下溶解，超声15 min，过滤，蒸干，残渣加入热水50 ml，玻璃棒搅拌下溶解，二氯甲烷振摇提取2次，20 ml/次，合并二氯甲烷液，置蒸发皿中放置通风橱内挥干，残渣用2 ml无水乙醇溶解，制成盐巴戟天供试品溶液。取缺盐巴戟天样品6 g，同法制成盐巴戟天阴性对照溶液。再取巴戟天对照药材2.5 g，置圆底烧瓶中，加入乙醇25 ml，置回流装置上加热1 h，中速滤纸滤过，滤液置蒸发皿中蒸干，自“残渣加入热水50 ml，玻璃棒搅拌下溶解”起制成巴戟天对照药材溶液。按薄层层析法，点样于同一硅胶G薄层板上，巴戟天对照药材、盐巴戟天供试品及盐巴戟天阴性对照溶液分别为1、2、2 μl，以甲苯 : 乙酸乙酯：甲酸=8∶4∶0.1预饱和15 min，展开，取出，晾干，365 nm荧光下检视。相比对照药材色谱，供试品显相同的蓝色或蓝白色荧光斑点，且阴性对照无干扰荧光斑点，见图2。

图2 盐巴戟天薄层色谱图（紫外365 nm）

2.1.3 熟地黄[5-7]取本品细粉2 g，置三角烧瓶中，加入甲醇30 ml，置超声仪上并设定温度为45℃，超声30 min，过滤，蒸干，残渣加入热水30 ml，玻璃棒搅拌下溶解，水饱和正丁醇提取3次，30 ml/次，合并正丁醇液，以正丁醇饱和的水洗涤2次，60 ml/次，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 ml溶解，制成供试品溶液。再取缺熟地黄阴性样品细粉2 g，自“置三角烧瓶中，加入甲醇50 ml，置超声仪上并设定温度为45℃，超声30 min”起制成阴性对照溶液。另取熟地黄对照药材2 g，自“置三角烧瓶中，加入甲醇30 ml，置超声仪上并设定温度为45℃，超声30 min”起制成对照药材溶液。按薄层层析法，点样于同一硅胶GF254薄层板上，对照药材、供试品及阴性对照溶液分别为10、3、3 μl，以石油醚（60～90℃） ∶乙酸乙酯=1∶1为展开剂，预饱和15 min，展开，取出，晾干，254 nm荧光下检视。相比对照药材色谱，供试品显相同浅黑色或黑色荧光斑点，且阴性对照无干扰荧光斑点，见图3。

图3 熟地黄薄层图谱图（紫外254 nm）

2.2 淫羊藿苷含量测定[8-12]

2.2.1 对照品溶液的制备 取淫羊藿苷0.0135 g，加甲醇定容至100 ml，超声溶解，制成对照品溶液（0.135 mg/ml）。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品细粉约7.5 g，精密称定，同“2.1.1 淫羊藿”供试品制备方法，制得“残渣”用无水乙醇溶解，转移至5 ml量瓶中，加无水乙醇定容至刻度，摇匀后用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取缺淫羊藿阴性样品细粉约7.5 g，精密称定，同“2.2.2”制成阴性对照溶液。

2.2.4 色谱条件[13]色谱柱：Rigol Compass C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相乙腈∶水=28∶72（v/v），柱温30℃，检测波长270 nm，流速1.0 ml/min，进样量10 μl，淫羊藿苷峰理论板数≥3000。

2.2.5 方法学考察[14]系统适用性试验：取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各10 μl（平行2次），按“2.2.4”色谱条件进样测定，结果显示供试品与对照品色谱相应的保留时间出现相应的淫羊藿苷峰，而阴性对照在该处无该淫羊藿苷峰，分离度＞2.0，理论板数按淫羊藿苷峰计算≥3000。见图4～6。

图4 淫羊藿苷对照品

图5 供试品

图6 淫羊藿阴性对照

线性关系考察：分别取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成质量浓度为0.025、0.050、0.100、0.200、0.300 mg/ml的对照品溶液。每个浓度组进样10 μl（每组进样两次），按“2.2.4”色谱条件项测定，记录淫羊藿苷峰面积。以淫羊藿苷浓度（mg/ml）为x坐标轴、平均峰面积为y坐标轴，计算得线性回归方程及质量浓度范围分别为：y=13 524.5915x-22.6651（R2=0.9999），淫羊藿苷在0.025～0.300 mg/ml区间内呈良好的线性关系。见图7。

图7 淫羊藿苷线性关系考察拟合方程

精密度试验：取适量“2.2.1”项对照品溶液，按“2.2.4”项色谱条件，连续进样同一对照品溶液6次，每次进样量为10 μl，记录各峰面积。结果RSD为1.27%，表明该色谱仪精密度良好。

稳定性试验：取“2.2.2”项同一供试品溶液适量（批号：20210812），室温放置0、4、8、10、12 h后，按“2.2.4”项色谱条件，进样10 μl（平行2次）测定，记录各淫羊藿苷峰面积，计算出RSD为1.63%（n=5），表明在室温下12 h内供试液的性质稳定。

重复性试验：取同批次样品（批号：20210812）约7.5 g，精密称定，按“2.2.2”项制备供试品溶液，共6份，再按“2.2.4”项色谱条件进样测定，进样量为10 μl，得淫羊藿苷的平均含量为0.14 mg/mg，计算出RSD为1.84%（n=6），表明本品含量测定方法重复性良好。

加样回收率试验：取同批次（批号：20210812），已知淫羊藿苷含量6个样品，每份约7.5 g，精密称定，置100 ml锥形瓶中，按“2.2.2”项下制备供试品溶，共6份，各精密量取0.5 ml，分别加入浓度为0.135 mg/ml的淫羊藿苷对照品试液1.1 ml，充分摇动直到混合均一，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，再按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，进样量为10 μl，记录峰面积，计算平均加样回收率为103.51%，RSD为1.44%，结果显示该方法具有良好的回收率。见表1。

表1 淫羊藿苷加样回收率试验结果（n=6）

样品中淫羊藿苷含量测定：取连续3批次样品约7.5 g，精密称定，置100 ml锥形瓶中，分别按“2.2.2”项制备供试品溶，再按“2.2.4”项下色谱条件进样测定，进样量为10 μl，平行2次进样。见表2。

表2 补肾生精片中淫羊藿苷的测定结果（n=2）

3 讨论

本研究在原制剂注册标准的基础上增加了淫羊藿、盐巴戟天、熟地黄三味药材的薄层鉴别方法。经过方法学考察，新增三味药材薄层鉴别色谱特征斑点明显，阴性对照无干扰，可纳入该品种制剂质量标准。

在含量测定中采用了两种方法制备本品供试品：方法一参考《中华人民共和国药典》2020年版淫羊藿“含量测定”[15]下的供试品制备方法，结果检测的杂质成分多、淫羊藿苷色谱峰不明显；方法二参考定性鉴别中“2.1.1淫羊藿”的供试品制备方法，结果显示经提纯后的供试品杂质成分少、淫羊藿苷色谱峰明显。后经方法学验证，方法二的供试品制备方法重现性好、成分稳定性好。如该制剂市场化，可以把本品所含淫羊藿苷的含量作为质量控制指标申请药品注册批件。