乌司他丁调节CCL2-CCR2信号轴对胃癌细胞上皮-间质转化和免疫逃逸的影响分析

王芳 胡洁琼 冯彦虎 何东

（1.兰州大学第二医院消化科，兰州 730030；2.兰州大学第二医院第二临床医学院，兰州 730030）

胃癌（gastric cancer，GC）是世界上癌症死亡的主要原因，近年来其发病率急剧升高［1］。尽管GC患者的管理和治疗有所改善，但总体五年生存率仍然较低［2］。因此仍需开发更安全的新型药物以提高患者生存质量并改善患者预后。乌司他丁（Ulinastatin，UTI）在抑制肿瘤进展方面具有突出作用，能显著抑制乳腺癌细胞增殖并促进细胞凋亡［3］。此外，研究发现UTI可抑制前列腺癌、GC细胞的增殖、迁移与侵袭，但其对GC细胞恶性行为的影响仍需进一步研究［4-5］。C-C趋化因子配体2（C-C motif chemokine ligand 2，CCL2）通过参与肿瘤免疫耐受调节诱导肿瘤血管生成，促进肿瘤细胞的生长与存活、侵袭和转移，从而在肿瘤的发生发展中发挥重要作用［6］。CCL2与C-C趋化因子受体2（C-C motif chemokine receptor 2，CCR2）相互作用，通过募集肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）促进程序性死亡配体1（programmed death ligand 1，PD-L1）信号传导，诱导免疫逃逸，从而促进食管癌的发生［7］。但UTI通过调节CCL2-CCR2信号轴对GC细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和免疫逃逸的影响尚不明确。因此本实验旨在探讨UTI对GC细胞EMT和免疫逃逸的影响及其作用机制，以期为临床治疗GC提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本收集和细胞来源 收集2021年3月至2022年12月期间于兰州大学第二医院首次确诊为GC的患者癌组织及癌旁组织（距离癌组织5 cm），共40对。样本存入冻存管置于超低温冰箱中冻存。所有患者均未接受化疗或放疗等形式的治疗。本研究获得兰州大学第二医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。人胃黏膜细胞GES-1及人GC细胞系MGC803、AGS、HGC27、BGC-823、SGC-7901购于美国ATCC。

1.1.2 主要试剂与仪器 乌司他丁（PRO-321）购于艾美捷科技有限公司；MTT试剂盒（M1020）、蛋白提取试剂盒（BC3790-50T）、RNA提取试剂盒（R1200）、反转录试剂盒（RP1105）、实时荧光定量PCR试剂盒（T2210）购于北京Solarbio；DEAE-Dextran细胞转染试剂盒（HB20232yy）购于上海化邦生物科技有限公司；CCL2过表达质粒（pcDNA3.1-CCL2）及对照（pcDNA3.1）和CCL2、CCR2引物购于广州RiboBio；干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ，IBE10033）、白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2，IBE10055）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，IB-E10131） ELISA试剂盒购于江西艾博因生物科技有限公司；兔源一抗基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2，ab37150）、PD-L1（ab239749）、CCL2（ab214819）、CCR2（ab223366）、E-钙黏蛋白（E-cadherin，ab308347）、波形蛋白（Vimentin，ab137321）、GAPDH（ab9485）及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（ab6721）购于美国Abcam公司；多功能酶标仪（LD-96A）购于山东莱恩德智能科技有限公司；离心机（5424）购于艾本德中国有限公司；实时荧光定量PCR仪（CFX96 Touch）购于上海艾研生物科技有限公司；光学显微镜（CX31）购于日本奥林巴斯公司；流式细胞仪（NOVOCYTE3130）购于美国艾森公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR检测CCL2、CCR2表达 Trizol试剂提取组织和细胞的总RNA。以RNA为模板合成cDNA后，再以cDNA为模板设置qRT-PCR反应体系。CCL2-F：5'-TCATAGCTACCACCATCAGTCCTCAG-3'和CCL2-R：5'-CTGGCTGCTTGTGATTCTCCTGTAG-3'；CCR2-F：5'-CGCTTCGGCAGCATTACT-3'和CCR2-R：5'-GTCGAGATGGGATACCCTT-3'；GAPDHF：5'-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3'和GAPDHR：5'-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3'；以2-ΔΔCt法计算组织和细胞中CCL2、CCR2的相对表达量。

1.2.2 MTT实验检测细胞增殖［4］将AGS细胞以1×104个/孔接种至96孔板进行常规培养，设6个复孔，培养24 h后，加入含0、100、200、400、800 U/ml UTI的培养液48 h后，以20 μl/孔加入MTT溶液，再培养4 h后，加入二甲基亚砜（150 μl/孔），充分振荡后，酶标仪检测490 nm波长处各孔的吸光度（A490）值，计算细胞增殖抑制率（%）。

1.2.3 细胞干预与分组 将AGS细胞分为control组（正常培养）、UTI组（400 U/ml）、pcDNA组（转染pcDNA3.1+UTI干预）、pcDNA-CCL2组（转染pc-DNA3.1-CCL2+UTI干预），使用转染试剂盒进行转染，按照1.2.1中qRT-PCR方法检测转染后各组CCL2、CCR2表达。除control外，其余各组均采用400 U/ml UTI进行干预48 h。

1.2.4 细胞增殖检测 各组AGS细胞按照800～1 000个细胞接种于6孔板，连续培养14 d，固定后用0.5%结晶紫溶液染色观察集落形成数。

1.2.5 细胞迁移与侵袭实验 各组AGS细胞生长至对数期时，使用涂有Matrigel基质胶的Transwell小室进行侵袭实验；迁移实验未涂Matrigel基质胶。各组取200 μl（2×105个）细胞悬液加入上室，下室加入600 μl含10%FBS的DMEM培养基培养24 h，固定染色，显微镜下随机选取6个视野计算迁移与侵袭细胞数。

1.2.6 IFN-γ、IL-2、TNF-α水平检测 使用Ficoll试剂盒从健康志愿者全血中分离和纯化人类外周血单核细胞，再用流式细胞仪从外周血单核细胞中分离出CD8+T细胞。将CD8+T细胞分为T细胞组（CD8+T细胞）、共培养组（AGS和CD8+T细胞共培养）、UTI组（AGS和CD8+T细胞共培养+400 U/ml UTI）、pcDNA组（转染pcDNA后，AGS和CD8+T细胞共培养+400 U/ml UTI）、pcDNA-CCL2组（转染pc-DNA-CCL2后，AGS和CD8+T细胞共培养+400 U/ml UTI），通过Transwell小室将AGS细胞和CD8+T细胞共培养48 h，收集各组细胞，根据ELISA试剂盒说明书检测CD8+T细胞上清中IFN-γ、IL-2、TNF-α水平。

1.2.7 细胞凋亡检验 收集各组细胞，以预冷的PBS洗涤2次，添加100 μl结合缓冲液悬浮各组细胞，再分别添加Annexin V-FITC和PI染液5 μl，混匀后避光染色15 min，离心弃上清，加入0.5 ml PBS重悬细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.8 MMP-2、E-cadherin、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白检测 采用Western blot检测蛋白表达，MMP-2、E-cadherin、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2及GAPDH一抗按照1∶1 500稀释，HRP标记的二抗按照1∶1 000稀释，实验结束后，以GAPDH为内参，采用Image J软件分析各蛋白表达。

1.3 统计学分析 采用SPSS25.0软件对数据进行统计分析，计量资料以xˉ±s表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCL2、CCR2在组织和细胞中的表达 与癌旁组织比较，GC癌组织中CCL2、CCR2蛋白及mRNA表达水平升高（P＜0.05），见图1、表1；与GES-1细胞比较，MGC803、AGS、HGC27、BGC-823、SGC-7901细胞中CCL2、CCR2蛋白及mRNA表达水平升高（P＜0.05），且AGS细胞中CCL2、CCR2蛋白及mRNA表达水平最高，因此，选择AGS细胞进行后续实验，见图2、表2。

表1 CCL2、CCR2在组织中的表达（±s，n=40）Tab.1 Expressions of CCL2 and CCR2 in tissues （±s，n=40）

表1 CCL2、CCR2在组织中的表达（±s，n=40）Tab.1 Expressions of CCL2 and CCR2 in tissues （±s，n=40）

Note：Compared with adjacent tissues， 1）P＜0.05.

Groups CCL2/GAPDH CCR2/GAPDH CCL2 mRNA CCR2 mRNA Adjacent tissues GC cancer tissue 0.18±0.04 0.36±0.05 1.01±0.01 1.00±0.00 1.35±0.101）1.49±0.131）1.52±0.081）1.39±0.091）

表2 CCL2、CCR2在细胞中的表达（±s，n=6）Tab.2 Expressions of CCL2 and CCR2 in cells （±s，n=6）

表2 CCL2、CCR2在细胞中的表达（±s，n=6）Tab.2 Expressions of CCL2 and CCR2 in cells （±s，n=6）

Note：Comparison with GES-1 cells， 1）P＜0.05.

Groups CCL2 mRNA CCR2 mRNA 1.00±0.00 1.51±0.141）2.39±0.211）1.49±0.161）1.84±0.121）1.94±0.151）GES-1 MGC803 AGS HGC27 BGC-823 SGC-7901 CCL2/GAPDH 0.21±0.04 1.28±0.091）1.89±0.131）1.31±0.111）1.49±0.131）1.62±0.151）CCR2/GAPDH 0.36±0.06 1.25±0.101）1.74±0.121）1.36±0.141）1.43±0.121）1.58±0.131）1.00±0.00 1.45±0.131）2.46±0.171）1.53±0.141）1.96±0.151）2.13±0.181）

图1 Western blot检测组织中CCL2、CCR2蛋白表达Fig.1 Western blot analysis of CCL2 and CCR2 protein expressions in tissues

图2 Western blot检测细胞中CCL2、CCR2蛋白表达Fig.2 Western blot analysis of CCL2 and CCR2 protein expressions in cells

2.2 UTI对AGS细胞的增殖抑制情况 与0 U/ml比较，AGS细胞的增殖抑制率在100、200、400、800 U/ml UTI干预下以剂量依赖性方式显著升高（P＜0.05），IC50=469.894 U/ml，本研究选取400 U/ml UTI进行后续实验，见表3。

表3 不同浓度UTI对AGS细胞增殖抑制率的影响（±s，n=6）Tab.3 Proliferation inhibition rate of AGS cells by different concentrations of UTI （±s，n=6）

表3 不同浓度UTI对AGS细胞增殖抑制率的影响（±s，n=6）Tab.3 Proliferation inhibition rate of AGS cells by different concentrations of UTI （±s，n=6）

Note：Compared with 0 U/ml UTI group，1）P＜0.05； compared with 100 U/ml UTI group，2）P＜0.05； compared with 200 U/ml UTI group，3）P＜0.05； compared with 400 U/ml UTI group， 4）P＜0.05.

Proliferation inhibition rate/%0 9.35±1.421）22.57±2.691）2）41.26±2.731）2）3）68.14±3.281）2）3）4）469.894 U/ml Groups 0 U/ml 100 U/ml 200 U/ml 400 U/ml 800 U/ml IC50

2.3 UTI对AGS细胞中CCL2、CCR2 mRNA表达的影响 与control组比较，UTI组AGS细胞中CCL2、CCR2 mRNA表达水平降低（P＜0.05）；与pcDNA组比较，pcDNA-CCL2组AGS细胞中CCL2、CCR2 mRNA表达水平升高（P＜0.05），提示pcDNA-CCL2转染成功，见表4。

表4 各组AGS细胞中CCL2、CCR2 mRNA表达比较（±s，n=6）Tab.4 Comparison of CCL2 and CCR2 mRNA expressions in AGS cells in each group （±s，n=6）

表4 各组AGS细胞中CCL2、CCR2 mRNA表达比较（±s，n=6）Tab.4 Comparison of CCL2 and CCR2 mRNA expressions in AGS cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with pcDNA group， 2）P＜0.05.

CCR2 mRNA 1.00±0.02 0.31±0.051）0.34±0.06 1.19±0.112）Groups Control UTI pcDNA pcDNA-CCL2 CCL2 mRNA 1.00±0.03 0.24±0.041）0.26±0.05 1.25±0.102）

2.4 UTI对AGS细胞增殖能力的影响 与control组比较，UTI组AGS细胞集落形成数显著减少（P＜0.05）；与pcDNA组比较，pcDNA-CCL2组AGS细胞集落形成数显著增多（P＜0.05），见图3、表5。

表5 各组AGS集落形成数比较（±s，n=6）Tab.5 Comparison of AGS colony formation in each group （±s，n=6）

表5 各组AGS集落形成数比较（±s，n=6）Tab.5 Comparison of AGS colony formation in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with pcDNA group， 2）P＜0.05.

Number of colony formation 176.39±6.72 62.28±4.251）65.47±4.31 134.19±5.322）Groups Control UTI pcDNA pcDNA-CCL2

图3 各组细胞集落形成数比较Fig.3 Comparison of cell colony formation in each group

2.5 UTI对AGS细胞迁移与侵袭能力的影响 与control组比较，UTI组AGS细胞迁移与侵袭细胞数显著减少（P＜0.05）；与pcDNA组比较，pcDNA-CCL2组AGS细胞迁移与侵袭细胞数显著增多（P＜0.05），见图4、表6。

表6 各组AGS细胞迁移与侵袭细胞数比较（±s，n=6）Tab.6 Comparison of migration and invasion of AGS cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with pcDNA group， 2）P＜0.05.

Groups Invasive cell counts 128.49±5.68 46.28±3.261）44.37±3.49 99.05±4.622）Control UTI pcDNA pcDNA-CCL2 Number of migrating cells 159.38±6.23 62.34±4.391）61.07±4.25 127.45±5.212）

2.6 UTI对免疫细胞及免疫因子的影响 与T细胞组比较，共培养组CD8+T细胞IFN-γ、IL-2、TNF-α水平降低，细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与共培养组比较，UTI组CD8+T细胞IFN-γ、IL-2、TNF-α水平升高，细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与pcDNA组比较，pcDNA-CCL2组CD8+T细胞IFN-γ、IL-2、TNF-α水平降低，细胞凋亡率增加（P＜0.05），见图5、表7。

表7 各组CD8+T细胞凋亡和IFN-γ、IL-2、TNF-α水平比较（±s，n=6）Tab.7 Comparison of CD8+T cell apoptosis and IFN-γ，IL-2， TNF-α levels in each group （±s，n=6）

Note：Compared with T cell group， 1）P＜0.05； compared with co-culture group， 2）P＜0.05； compared with pcDNA group， 3）P＜0.05.

TNF-α/（ng·L-1）56.37±4.23 31.92±2.651）48.21±3.412）47.29±3.25 25.68±2.743）Groups T cell Co-culture UTI pcDNA pcDNACCL2 Apoptosis/%6.37±1.09 24.18±2.151）15.35±1.232）15.47±1.28 21.70±1.493）IFN-γ/（ng·L-1）42.73±3.15 25.96±2.311）37.68±2.422）38.32±2.46 20.53±1.843）IL-2/（ng·L-1）50.36±4.02 28.75±2.491）45.19±3.212）44.82±3.16 23.58±1.743）

2.7 UTI对MMP-2、E-cadherin、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表达的影响 与control组比较，UTI组AGS细胞中MMP-2、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表达水平显著降低，E-cadherin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与pcDNA组比较，pcDNACCL2组AGS细胞中MMP-2、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表达水平升高，E-cadherin蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），见表8、图6。

表8 各组AGS细胞中MMP-2、E-cadherin、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表达比较（±s，n=6）Tab.8 Comparison of MMP-2， E-cadherin， Vimentin， PD-L1， CCL2 and CCR2 protein expressions in AGS cells of each group （±s，n=6）

表8 各组AGS细胞中MMP-2、E-cadherin、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表达比较（±s，n=6）Tab.8 Comparison of MMP-2， E-cadherin， Vimentin， PD-L1， CCL2 and CCR2 protein expressions in AGS cells of each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with pcDNA， 2）P＜0.05.

CCR2 1.74±0.12 0.51±0.041）0.47±0.05 1.28±0.102）Groups Control UTI pcDNA pcDNA-CCL2 MMP-2 1.72±0.13 0.54±0.081）0.56±0.06 1.37±0.112）E-cadherin 0.28±0.05 1.25±0.101）1.21±0.08 0.43±0.062）Vimentin 1.31±0.12 0.27±0.051）0.34±0.07 1.04±0.102）PD-L1 1.29±0.10 0.18±0.031）0.23±0.04 0.96±0.082）CCL2 1.89±0.13 0.46±0.071）0.53±0.08 1.32±0.112）

图6 Western blot检测细胞中MMP-2、E-cadherin、Vimentin、PD-L1、CCL2、CCR2蛋白表达Fig.6 Western blot detects protein expressions of MMP-2，E-cadherin，Vimentin，PD-L1，CCL2 and CCR2 in cells

3 讨论

GC是常见的胃肠道恶性肿瘤，其发病率和病死率呈逐年上升趋势，严重威胁患者的生命健康［8-9］。尽管GC的手术和辅助治疗方面取得了巨大进展，但由于转移会导致癌症复发，GC患者的五年生存率较低［10］。因此，阐明GC转移所涉及的分子机制对于改善生存结局具有重要意义。

UTI在临床上主要用于急性胰腺炎或慢性复发性胰腺炎的治疗，近年研究发现，UTI在体内和体外均具有良好的抗肿瘤活性，其通过抑制细胞外调节蛋白激酶（ERK）抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖，并诱导细胞凋亡［3］。UTI通过下调尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）表达抑制高转移人卵巢癌细胞HO-8910PM的转移和侵袭［11］。UTI能够明显抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖和迁移，提示UTI可能是治疗胃癌的潜在策略［5］。SHEN等［12］发现UTI通过调节MMP-9和E-cadherin表达抑制肝癌细胞的转移，与姜黄素合用时效果更明显。EMT是细胞由上皮状态向间质状态转变，并使其获得迁移和侵袭行为的生物学过程，EMT在肿瘤转移、器官分化等多种生物学行为中扮演重要角色［13］。E-cadherin是维持上皮细胞极性的基因，在EMT发生过程中下调表达，间充质标记物如N-钙黏蛋白、Vimentin在EMT发生过程中上调表达。研究表明，EMT是GC细胞转移的重要步骤，与GC患者预后不良密切相关［14］。本研究中，UTI显著降低AGS细胞的集落形成数、迁移与侵袭数、MMP-2、Vimentin蛋白表达水平，上调Ecadherin蛋白表达。提示UTI在体外可抑制AGS细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT，UTI具有抗GC作用。

近年来，越来越多的证据表明肿瘤细胞具有抑制肿瘤微环境中T细胞分泌的TNF-α、IL-2和IFN-γ能力，从而有利于肿瘤细胞逃避免疫细胞的免疫检查，免疫逃逸对肿瘤的存活和发展至关重要［15］。据报道，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞可以募集免疫抑制细胞，如CD4+T细胞，以破坏CD8+T细胞的细胞毒性功能［16］。此外，PD-L1是B7家族配体，可与其受体程序性死亡蛋白-1（PD-1）结合，影响肿瘤特异性T细胞，诱导细胞凋亡并抑制CD8+T细胞活性，导致肿瘤中的免疫逃逸。临床上，大量研究表明，采用抗PD-1抗体阻断PD-1检查点是不同癌症的有效免疫治疗方法［17］。研究发现，UTI具有免疫调节作用，可显著增加食管癌手术患者中免疫相关细胞因子（NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞及活化的T细胞亚群）水平，增强患者免疫功能［18］。不同剂量的UTI对腹腔镜结直肠癌手术患者的细胞免疫具有一定影响［19］。本研究发现，UTI能提高CD8+T细胞内IFN-γ、IL-2、TNF-α水平，降低CD8+T细胞凋亡率及AGS细胞PD-L1蛋白表达。提示UTI通过提高免疫因子水平，抑制免疫细胞凋亡和免疫逃逸，抑制AGS细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT，从而发挥抗GC作用。

CCL2是免疫系统中重要的调节因子，CCL2-CCR2通路激活可抑制免疫细胞活化，有利于恶性肿瘤发展［20］。研究表明，在肝细胞癌中，阻断CCL2-CCR2信号通过激活T细胞抗肿瘤免疫反应抑制小鼠肝肿瘤生长，抑制癌细胞的恶性生长和转移，减少术后复发，提高生存率［21］。CCL2-CCR2通路的激活可促进顺铂耐药GC细胞的EMT和肿瘤血管生成［22］。CCL2-CCR2的激活与巨噬细胞的浸润极化有关，M2极化增加了巨噬细胞中PD-L2的表达，导致食管癌细胞发生免疫逃逸，进而促进食管癌的发生发展［7］。本研究发现，UTI能抑制CCL2、CCR2 mRNA及蛋白表达，且过表达CCL2后，提高了CCL2、CCR2 mRNA表达及免疫因子水平，促进免疫细胞凋亡，从而减弱了UTI对AGS细胞增殖、迁移、侵袭及EMT的抑制作用。提示UTI可能通过抑制CCL2-CCR2信号通路抑制AGS细胞的EMT和免疫逃逸。

综上所述，UTI可能通过抑制CCL2-CCR2信号通路抑制AGS细胞的EMT和免疫逃逸。为治疗GC提供了新的药物及靶点参考，但本研究尚存在不足之处：UTI对其他靶点及通路研究仍有待阐明。课题组将在后续实验中进一步明确UTI对GC的作用。