水飞蓟素抑制鼻咽癌模型大鼠鼻黏膜组织炎症及损伤

徐辉聪 钟零珠 梁卫勤 王少军 （海口市第三人民医院耳鼻咽喉科，海口 571100）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是一种起源于鼻咽部的头颈部恶性肿瘤，其临床症状主要表现为鼻塞、涕中带血、耳闷、听力下降以及头痛等，因其临床症状不典型，发现时常已进展至中晚期［1］。目前，手术切除及放化疗可有效延长NPC患者的生存时间，但易造成放射性鼻窦炎等不良反应，从而影响NPC患者预后［2］。既往研究表明，NPC与EB病毒感染、遗传、环境等因素均密切相关，NPC发生过程中通常伴随炎症反应［3］。IL-6是存在于黏膜固有层的一种重要促炎因子，在炎症的发生发展中发挥关键作用［4］。信号传导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是IL-6信号通路的关键下游调节因子，可持续激活炎症反应并诱导细胞癌变［5-6］。

中药因其安全、不良反应小等优点，在临床防治NPC上可能具有良好的前景，既往研究通过体内外实验证实中药对NPC的治疗效果显著［7］。水飞蓟素（Silymarin，SIL）是从菊科植物水飞蓟种子或果实中提取出的一种黄酮木质素类化合物，具有消炎、抗氧化、调节免疫以及抗肿瘤等作用［8］。研究显示，SIL与临床上一些常规化疗药物具有一定的协同作用，在临床上能够有效发挥抗肿瘤作用［9］。本研究通过建立NPC大鼠模型，观察SIL对NPC大鼠鼻黏膜损伤的保护作用，并初步探究SIL的可能作用机制，旨在为SIL用于临床上NPC防治提供一定理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级SD大鼠共60只，6～7周龄，体质量（200±20）g，购自中国医学科学院医学实验动物研究所，动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0011。实验前大鼠适应性饲养7 d，饲养条件温度22～25 ℃，湿度45%～55%，昼夜时长12 h/12 h，期间不限制饮水饮食。研究经海口市第三人民医院伦理委员会审核批准（审批号：2022013）。

1.1.2 实验药物与试剂 二亚硝基哌嗪（dinitrosopiperazine，DNP，SCSI-316048）购自上海赛可瑞生物科技有限公司；佛波醇酯（SL9964626）购自上海一基实业有限公司；SIL（B3746）购自北京康纳瑞生物科技有限公司；IL-6/STAT3通路抑制剂（AG-490，HY-107459）购自美国MCE公司；HE染色试剂盒（G1120）、DAB显色试剂盒（DA1016）、ECL发光试剂盒（PE0010）均购自北京索莱宝生物科技有限公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（YT2205）购自北京伊塔生物科技有限公司；IL-6、IL-10、IL-1β ELISA试剂盒（H007-1-1、H009-1、H002）均购自南京建成生物工程研究所；UBAP1抗体（ab89124）、IL-6抗体（ab259341）、STAT3（ab68153）、β-actin（ab8227）、山羊抗兔（HRP，ab6721）均购自英国Abcam公司。

1.1.3 实验仪器 OLYMPUS IX53显微镜购自日本OLYMPUS公司；GelView 5000Plus智能凝胶成像系统购自广州博鹭腾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立与分组给药 参照文献［10］建立NPC大鼠模型：取50只SD大鼠，腋部皮下注射诱癌剂DNP 15 mg/kg，同时注射促癌剂佛波醇酯100 mg/kg，每3 d注射1次，7 d测量1次体质量，根据体质量变化调整用药量，连续注射90 d。大鼠出现涕流满面、抓鼻不止、频繁打喷嚏等行为后进行组织病理检测，以鼻咽组织出现癌变细胞表明NPC大鼠模型建立成功。建模成功后将大鼠随机分为模型组、SIL-L组（50 mg/kg）、SIL-M组（100 mg/kg）、SIL-H组（200 mg/kg）、SIL+AG-490组（SIL200 mg/kg加AG-490 2 mg/kg混合液）。另选10只大鼠腋部皮下注射生理盐水，作为空白对照组［11-12］。造模成功后各组给予相应药物治疗。模型组与空白对照组给予等体积生理盐水。给药方式均为腹腔注射，1次/d，连续给药90 d。

1.2.2 ELISA法检测鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β水平 末次给药后12 h，用1%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，行气管切开术。微量蠕动泵灌洗鼻腔，并收集鼻腔灌洗液，2 500 r/min离心15 min，取上清，ELISA检测IL-6、IL-10、IL-1β。操作严格按试剂盒说明书进行。

1.2.3 HE染色观察鼻黏膜组织病理变化 每组取5只大鼠取鼻黏膜组织，4%多聚甲醛中固定，常规石蜡切片，HE染色后生物光学显微镜下观察鼻黏膜组织病理学变化。

1.2.4 TUNEL法检测鼻黏膜组织细胞凋亡 取1.2.3中制备好的组织切片，常规脱蜡处理、二甲苯透明、梯度乙醇脱水后加蛋白酶K室温孵育15 min，PBS漂洗，采用过氧化氢封闭10 min，再次漂洗，加入TUNEL工作液，进行染色，生物光学显微镜下观察鼻咽组织细胞凋亡情况并拍照。采用Image J 7.0软件进行图像分析。细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数（棕色）/细胞总数×100%。

1.2.5 免疫组化检测鼻黏膜组织中UBAP1的表达 取1.2.3制备好的组织切片，脱蜡至水，枸橼酸修复抗原，5%BSA封闭2 h，加入UBAP1一抗，4 ℃孵育过夜，加入二抗，37 ℃孵育2 h，DAB显色，光镜下观察切片并拍照，采用Image J 7.0软件分析积分光密度值，作为目的蛋白阳性表达量。

1.2.6 Western blot检测鼻黏膜组织中IL-6、STAT3蛋白表达 取大鼠鼻黏膜组织，使用RIPA裂解液分离总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白上样，进行电泳、转膜，5%BSA封闭2 h，加入IL-6、STAT3及内参β-actin一抗，4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，电化学发光试剂（efficient chemiluminescence，ECL）显色，凝胶成像系统分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参蛋白，计算目的蛋白的相对表达量，目的蛋白表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0统计学软件分析实验数据，计量资料以±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SIL对NPC大鼠鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β水平的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β水平明显升高，IL-10水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，SIL-L、SIL-M、SIL-H组鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β水平依次降低，IL-10水平依次升高（P＜0.05），显示出药物具有剂量效应关系；与SIL-H组比较，SIL+AG-490组鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β水平显著降低，IL-10水平显著升高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β水平的比较（±s，n=10，pg/ml）Tab.1 Comparison of IL-6， IL-10 and IL-1β levels in nasal lavage fluid of rats in each group （±s，n=10，pg/ml）

表1 各组大鼠鼻腔灌洗液中IL-6、IL-10、IL-1β水平的比较（±s，n=10，pg/ml）Tab.1 Comparison of IL-6， IL-10 and IL-1β levels in nasal lavage fluid of rats in each group （±s，n=10，pg/ml）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05；compared with SIL-L group， 3）P＜0.05； compared with SIL-M group， 4）P＜0.05； compared with SIL-H group，5）P＜0.05.

IL-1β 24.25±2.28 87.18±8.371）73.84±7.182）65.86±5.952）3）53.21±5.342）3）4）34.82±3.285）Groups Control Model SIL-L SIL-M SIL-H SIL+AG-490 IL-6 35.47±3.56 121.49±10.261）94.16±8.662）78.58±6.852）3）61.28±5.582）3）4）49.54±4.225）IL-10 47.51±3.13 13.08±1.471）16.82±1.842）22.31±2.422）3）27.18±1.972）3）4）34.76±3.685）

2.2 SIL对NPC大鼠鼻黏膜组织病理变化的影响HE染色结果显示：空白对照组大鼠鼻黏膜组织结构清晰，细胞排列整齐、形状规则，未发现细胞癌变现象；模型组大鼠黏膜组织结构紊乱，大量细胞癌变，细胞层次增多，排列不规则；SIL各剂量组随着剂量的增加，细胞形态逐渐清晰，癌变细胞逐渐减少；SIL+AG-490组大鼠鼻黏膜组织结构、细胞形态与空白对照组接近，细胞层次较清晰，癌变细胞数量较少。见图1。

图1 各组大鼠鼻黏膜组织病理变化情况（HE，×200）Fig.1 Histopathological changes of nasal mucosa of rats in each group （HE，×200）

2.3 SIL对NPC大鼠鼻黏膜组织细胞凋亡情况的影响 空白对照组大鼠鼻黏膜组织中的细胞凋亡率为（3.79±0.43）%；与空白对照组比较，模型组大鼠鼻黏膜组织细胞凋亡率（52.91±4.36）%显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，SIL各剂量组随着剂量升高，鼻黏膜组织细胞凋亡率逐渐降低（P＜0.05），细胞凋亡率分别为（41.76±3.24）%、（32.01±2.33）%、（24.38±2.07）%；与SIL-H组比较，SIL+AG-490组大鼠鼻黏膜组织细胞凋亡率（16.43±1.71）%显著降低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组大鼠鼻黏膜组织细胞凋亡情况（TUNEL，×200）Fig.2 Apoptosis of nasal mucosal tissue cells of rats in each group （TUNEL，×200）

2.4 SIL对NPC大鼠鼻黏膜组织中UBAP1表达的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠鼻黏膜组织中UBAP1表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，SIL各剂量组大鼠鼻黏膜组织中UBAP1表达显著升高（P＜0.05），且具有剂量效应（P＜0.05）；与SIL-H组比较，SIL+AG-460组大鼠鼻黏膜组织中UBAP1表达显著升高（P＜0.05）。见图3、表2。

表2 各组大鼠鼻黏膜组织UBAP1表达的比较（±s，n=5）Tab.2 Comparison of UBAP1 expressions in nasal mucosal tissues of rats in each group（±s，n=5）

表2 各组大鼠鼻黏膜组织UBAP1表达的比较（±s，n=5）Tab.2 Comparison of UBAP1 expressions in nasal mucosal tissues of rats in each group（±s，n=5）

Nite：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with SIL-L group， 3）P＜0.05； compared with SIL-M group， 4）P＜0.05； compared with SIL-H group，5）P＜0.05.

UBAP1 7.41±0.66 1.96±0.211）3.01±0.292）3.98±0.42 2）3）4.96±0.492）3）4）5.83±0.545）Groups Control Model SIL-L SIL-M SIL-H SIL+AG-490

2.5 SIL对NPC大鼠鼻黏膜组织中IL-6、STAT3蛋白表达的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠鼻黏膜组织中IL-6、STAT3蛋白表达均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，SIL各剂量组大鼠鼻黏膜组织中IL-6、STAT3蛋白表达均明显降低（P＜0.05），且各剂量组间具有剂量效应（P＜0.05）；与SIL-H组比较，SIL+AG-460组大鼠鼻黏膜组织中IL-6、STAT3蛋白表达均明显降低（P＜0.05）。结果见图4、表3。

图4 各组大鼠鼻黏膜组织中IL-6、STAT3蛋白表达的比较Fig.4 Comparison of IL-6 and STAT3 protein expression in nasal mucosal tissues of rats in each group

表3 各组大鼠鼻黏膜组织中IL-6、STAT3蛋白表达的比较（±s，n=5）Tab.3 Comparison of IL-6 and STAT3 protein expression in nasal mucosal tissues of rats in each group（±s，n=5）

表3 各组大鼠鼻黏膜组织中IL-6、STAT3蛋白表达的比较（±s，n=5）Tab.3 Comparison of IL-6 and STAT3 protein expression in nasal mucosal tissues of rats in each group（±s，n=5）

Note：Compared with control group， 1）P＜0.05； compared with model group， 2）P＜0.05； compared with SIL-L group， 3）P＜0.05； compared with SIL-M group， 4）P＜0.05； compared with SIL-H group，5）P＜0.05.

STAT3 0.22±0.02 0.85±0.091）0.72±0.082）0.59±0.052）3）0.47±0.042）3）4）0.36±0.035）Groups Control Model SIL-L SIL-M SIL-H SIL+AG-490 IL-6 0.16±0.02 0.67±0.041）0.56±0.042）0.48±0.032）3）0.37±0.022）3）4）0.24±0.025）

3 讨论

据WHO统计，全球有约80%的NPC患者在中国，并且，近年来由于人们生活方式以及生活环境的改变，其发病率及年轻化程度均逐年升高［13-14］。NPC起病隐匿、病情发展迅速，大多数患者确诊时已发展至中晚期，且NPC发病与环境因素、遗传因素以及病毒感染等有密切关系［15-16］。早期放化疗能够有效延长患者生命，但长期放化疗易产生相关不良反应及放化疗抵抗，因此，寻找安全有效的治疗药物对于临床上NPC的防治工作具有重要意义。

IL-6、IL-1β是机体的关键促炎因子，研究表明其参与炎症反应发生、机体免疫应激以及肿瘤细胞的增殖与侵袭［17］。UBAP1在NPC的发生与发展过程中均呈异常表达，其在NPC癌细胞恶性行为学的发展过程中发挥关键作用［18］。本研究结果显示，NPC大鼠模型鼻腔灌洗液中IL-6、IL-1β水平升高，抑炎因子IL-10水平降低，鼻黏膜组织受损严重，鼻腔黏膜细胞癌变与凋亡增加，提示大鼠鼻腔黏膜炎症反应激活，可诱导鼻黏膜细胞癌变与凋亡，同时鼻黏膜组织中UBAP1表达降低，促进NPC发展。

刘易婷等［19］曾通过建立DNP与硫酸镍联合诱导NPC大鼠模型，发现益气解毒颗粒能够有效降低NPC大鼠癌变发生率。SIL是菊科植物水飞蓟的主要生物活性成分，其具有清除ROS、抗炎、抗氧化能力［20］。研究报道SIL抗肿瘤作用主要是通过抑制细胞凋亡、抵抗血管生成等作用抑制肿瘤生长［21］。本研究结果显示，低、中、高剂量的SIL均能不同程度地下调IL-6、IL-1β表达，上调IL-10表达，减轻鼻黏膜组织炎症反应及组织损伤，减少细胞癌变以及抑制鼻黏膜上皮细胞凋亡。

IL-6是参与调节免疫应答和炎症反应的关键因子，其通过与下游受体sIL-6R结合，诱导下游效应因子STAT3活化，从而进一步促进炎症因子的表达，加重机体损伤［22］。研究表明，IL-6/STAT3信号通路被激活后可引起过度炎症反应， STAT3过表达影响肿瘤细胞的清除进而促进肿瘤的发生发展［23］。因此，抑制IL-6/STAT3信号通路，能够有效减少NPC癌细胞增殖与侵袭［24］。本研究结果表明，NPC模型大鼠鼻黏膜组织中IL-6、STAT3蛋白表达明显升高，提示NPC模型大鼠机体IL-6/STAT3信号通路被激活，炎症反应加剧，从而促进鼻黏膜组织癌变，SIL-L、SIL-M、SIL-H组大鼠鼻咽部黏膜组织中IL-6、STAT3蛋白表达均有不同程度的下调，提示SIL可抑制IL-6/STAT3信号通路的激活；且SIL配伍通路抑制剂AG-490干预后，IL-6、STAT3蛋白表达进一步下调，说明SIL可能通过抑制IL-6/STAT3信号通路的激活，进而发挥抗炎、抗凋亡作用，缓解NPC大鼠鼻黏膜组织炎症损伤。

综上所述，SIL通过抑制炎症反应的发生和细胞凋亡减轻NPC大鼠鼻黏膜组织损伤，其作用机制可能与抑制IL-6/STAT3信号通路有关。