miR-150对T细胞PD-1表达及肺肿瘤生长的影响

张婷 郭晗 郑爱华 张爱红 郑全辉 （.华北理工大学基础医学院，河北省慢性疾病基础医学重点实验室，唐山 060；.华北理工大学基础医学院，唐山 060；.唐山市工人医院，唐山 06000）

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是长度为20～24个核苷酸的非编码小RNA，在转录后调节基因中表达，其中，miR-150主要在机体免疫系统中表达。既往研究发现，miR-150缺失不影响传统αβT细胞在胸腺中的产生和发育，但对自然杀伤性T细胞（nature killer T cells，NKT）的发育和功能发挥重要调控作用。本研究率先进一步探讨了miR-150对外周免疫器官和外周血中CD4 T、CD8 T细胞数量、活化表型分子和程序性细胞死亡分子1（programmed cell death 1，PD-1）表达的影响，进而采用小鼠肺移植肿瘤模型，探讨miR-150通过调控T细胞PD-1表达对肿瘤发展的影响。研究结果将为进一步探索以miRNAs为靶点的肿瘤免疫治疗提供新的线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6背景的miR-150基因敲除（miR-150 knock-out，miR-150KO）小鼠购自美国Jackson实验室（Stock No：007750），以正常野生型（wild-type，WT） C57BL/6小鼠作为对照。小鼠在华北理工大学SPF级小鼠房内饲养、繁殖，实验选取4～8周龄、性别匹配的小鼠进行研究。小鼠实验操作按照华北理工大学实验动物管理委员会规定进行，动物伦理审查编号：2013-008。提取miR-150KO和WT小鼠尾DNA，根据Jackson实验室推荐的PCR扩增程序和引物进行基因型鉴定（protocol 28985），正向引物：5'-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3'；反向引物：5'-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3'。miR-150KO鼠尾DNA扩增产生262 bp片段，WT鼠尾DNA扩增产生866 bp片段［1-3］。

1.1.2 细胞系 小鼠Lewis肺癌细胞系（Lewis lung cancer cell line，LLC）于2020年购自华拓生物科技有限公司，在含10%胎牛血清及双抗的高糖DMEM培养液中培养，条件为饱和湿度、37 ℃、5%CO2，2～3 d更换1次培养液。细胞总数达到95%融合时，用0.25%胰酶消化、传代培养。

1.1.3 主要试剂 胎牛血清购自Life Technologies；双抗（青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml）购自Gibco公司；高糖DMEM培养液购自HyClone公司；荧光标记的抗小鼠CD4、CD8、CD69和PD-1抗体购自美国BD公司；小鼠PD-1封闭抗体anti-mouse CD279（PD-1）购自Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 miR-150KO小鼠的DNA鉴定 取 2～3 mm小鼠鼠尾组织，加入75 μl 鼠尾裂解液，98 ℃裂解1 h。待温度降至室温后，加入等体积鼠尾中和液，充分吸打混匀后，1 000 r/min离心3 min。PCR反应结束后，行2%琼脂糖凝胶电泳（107 V，45 min），采用凝胶成像显影设备检测DNA条带，判断小鼠基因型。

1.2.2 流式细胞术分析 采用miR-150KO和WT小鼠，每组3～5只。分离各组小鼠脾脏、淋巴结细胞和外周血白细胞，采用荧光标记的抗小鼠CD4、CD8、CD69和PD-1抗体进行细胞表面染色（4 ℃30 min）。染色后洗涤细胞，采用Beckman流式细胞仪收集标本，Flow Jo软件进行数据分析。

1.2.3 荷瘤小鼠模型制备 消化、收集LLC细胞，离心去上清，用无菌PBS洗涤2次，将细胞悬浮于无菌PBS中，台盼蓝染色细胞活力大于95%。选取雌性miR-150KO和WT小鼠，每组3～5只，将1×106个LLC细胞悬浮于100 μl PBS中，接种到各组小鼠腋窝皮下。每隔1 d通过游标卡尺测量肿瘤尺寸，并使用以下公式估计肿瘤体积：肿瘤体积（mm3）=长轴×短轴2×1/2。第21天处死小鼠，收集并分析外周血和淋巴结T细胞中PD-1的表达变化。

1.2.4 抗PD-1抗体治疗 分组及制备miR-150KO和WT小鼠肿瘤模型同上，在注射LLC细胞系5 d后，采用抗PD-1抗体，根据文献［4］以250 μg/小鼠（19～21 g）进行腹腔注射。每隔1 d通过游标卡尺测量各组小鼠肿瘤大小变化，持续观察2周。

1.3 统计学分析 采用GraphPad Prism v9软件进行统计学分析，通过Student'st检验评估统计显著性，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-150敲除对T细胞数量的影响 PCR鉴定鼠尾DNA，miR-150KO小鼠产生262 bp扩增片段，WT小鼠产生866 bp扩增片段，小鼠基因型鉴定正确（图1A）。分离miR-150KO和WT小鼠脾脏、淋巴结和外周血细胞，流式分析各组织CD4+T和CD8+T细胞数量变化。结果发现：与WT小鼠相比，miR-150KO小鼠脾脏中CD8+T细胞无明显变化，CD4+T细胞比例和数量显著升高（P＜0.01或P＜0.05，图1B、C）；与WT小鼠相比，miR-150KO小鼠淋巴结中CD8+T细胞无显明显化，但CD4+T细胞比例和数量显著升高（P＜0.01，图1D、E）；与WT小鼠相比，miR-150KO小鼠外周血中CD4+T和CD8+T细胞比例显著降低（P＜0.01，图1F）。

图1 miR-150KO小鼠T细胞比例和数量变化Fig.1 Changes in proportion and number of T cells in miR-150KO mice

2.2 miR-150敲除对T细胞活化的影响 流式分析miR-150KO和WT小鼠脾脏、淋巴结和外周血T细胞活化差异。结果发现：与WT小鼠相比，miR-150KO小鼠脾脏CD4 T和CD8 T细胞中CD69+细胞比例无显著变化（图2A）；与WT小鼠相比，miR-150KO小鼠淋巴结CD4 T和CD8 T细胞中CD69+细胞比例显著升高（P＜0.05，图2B）；与WT小鼠相比，miR-150KO小鼠外周血中CD4 T和CD8 T细胞CD69+细胞比例也显著升高（P＜0.01或P＜0.05，图2C）。

2.3 miR-150敲除对T细胞PD-1表达的影响 流式分析miR-150KO和WT小鼠淋巴结、外周血CD4 T和CD8 T细胞中PD-1的表达变化。结果发现：与WT小鼠相比，miR-150KO小鼠淋巴结CD4 T和CD8 T细胞中PD-1+细胞比例无显著变化（图3A）；与WT小鼠相比，miR-150KO小鼠外周血CD4 T和CD8 T细胞中PD-1+细胞比例显著升高（P＜0.01，图3B）。

图3 miR-150KO小鼠T细胞PD-1表达变化Fig.3 Changes of PD-1 expression in T cells of miR-150 KO mice

2.4 miR-150敲除对小鼠肺肿瘤生长的影响 与WT小鼠相比，miR-150KO小鼠肿瘤生长明显加快（图4A、B）；流式分析miR-150KO和WT小鼠淋巴结和外周血CD4 T和CD8 T细胞中PD-1表达变化。结果发现：与WT荷瘤小鼠相比，miR-150KO荷瘤小鼠淋巴结CD4 T和CD8 T中细胞PD-1+细胞比例显著升高（P＜0.01，图4C）；与WT荷瘤小鼠相比，miR-150 KO荷瘤小鼠外周血CD4 T和CD8 T细胞中PD-1+细胞比例也显著升高（P＜0.01，图4D）。

2.5 抗PD-1抗体处理对miR-150KO和WT小鼠肿瘤生长的影响 采用抗PD-1封闭抗体腹腔注射miR-150KO和WT荷瘤小鼠，观察其对肿瘤生长的影响。结果发现：抗PD-1抗体处理几乎不影响WT小鼠的肿瘤生长，但对miR-150KO小鼠的肿瘤生长具有明显抑制作用（P＜0.05，图5）。

图5 抗PD-1抗体处理对miR-150KO和WT荷瘤小鼠肿瘤生长的影响Fig.5 Tumor growth in miR-150KO and WT tumor bearing mice after treatment of anti-PD-1 antibody

3 讨论

miR-150主要表达在免疫系统中。课题组的前期研究显示，miR-150敲除对胸腺传统T细胞的产生和发育无明显影响，但导致NKT细胞的发育和功能异常［5］。本研究进一步探讨了miR-150对外周免疫器官和外周血中传统T细胞数量和表型的影响。与课题组的既往研究结果一致，与WT小鼠相比，miR-150敲除小鼠外周血中CD4+T和CD8+T细胞显著降低［3］。但本研究进一步发现miR-150敲除导致小鼠淋巴结和脾脏中CD4+T细胞显著增加。其原因可能与miR-150对NKT细胞迁移的影响相似，miR-150敲除诱导趋化因子受体7（chemokine receptor 7，CCR7）和CCR9表达增加，导致CD4+T细胞从血液向脾脏和淋巴结的迁移增加［6-7］。有研究发现，miR-150敲除可促进某些自身免疫病的发生，提示miR-150敲除可能促进T细胞的异常活化［6，8-10］。本研究发现，miR-150敲除导致CD4 T和CD8 T细胞中CD69表达显著增加，表明miR-150敲除导致传统T细胞活化显著增强，可能是导致自身免疫病发生、发展的主要原因之一。

近年研究发现，免疫检查点分子PD-1在T细胞中的表达变化影响肿瘤的发生发展［11-13］。在此研究中，课题组又深入探讨了miR-150敲除对正常和荷瘤小鼠CD4 T和CD8 T细胞中PD-1的表达影响，发现在正常小鼠中，miR-150敲除导致外周血CD4 T和CD8 T细胞中PD-1表达显著增加。在荷瘤小鼠中，miR-150敲除导致淋巴结和外周血CD4 T和CD8 T细胞中PD-1表达也显著增加。另外，研究发现miR-150敲除对移植肺肿瘤具有促进作用，可见miR-150可通过抑制T细胞中PD-1表达，降低对肿瘤的免疫耐受，进而抑制其发生或发展。已有研究表明，miR-150在非小细胞肺癌细胞中具有抑癌基因作用［14］。因此，miR-150既可通过肿瘤细胞本身，也可通过免疫系统抑制肺肿瘤生长，提示其对肺肿瘤治疗的潜在临床应用价值。

为进一步研究miR-150敲除通过PD-1对肺肿瘤发展的影响，课题组对miR-150KO和WT荷瘤小鼠腹腔注射抗PD-1封闭抗体。结果发现，抗PD-1抗体处理几乎不影响WT小鼠肿瘤的生长变化，但对miR-150KO小鼠肿瘤生长具有明显抑制作用。虽然抗PD-1抗体对血液系统肿瘤具有明显的抗肿瘤活性，但对实体瘤的治疗效果并不理想［15-16］。一般情况下需与放疗或化疗药物联合应用，才能产生更显著的效果［17-19］。另一方面，miR-150敲除导致T细胞PD-1表达增加，可能增加了抗PD-1抗体在miR-150KO小鼠中的作用靶点，进而增强了其对肿瘤的免疫杀伤效果。目前miR-150在T细胞中调控PD-1表达变化的机制还不清楚，需要在后续实验中进一步阐明。