阿尔茨海默病中免疫检查位点LAG3的研究

孟凌云 段冉 陈静 （.泰安市中心医院，泰安 7000；.泰安市妇幼保健院，泰安 7000；.山东第一医科大学基础医学院，济南 507）

在众多神经系统疾病当中，阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的发病率最高，在疾病早期会出现记忆和认知障碍，晚期更是会导致自理能力的丧失，被称为“不死的癌症”，给社会带来了沉重的负担［1］。其主要病理特征为β淀粉样蛋白（amyloid β，Aβ）的沉积以及细胞内Tau蛋白磷酸化形成的神经纤维缠结［2-4］。目前很多研究提示，神经炎症机制在AD的发生以及发展过程中起到重要作用［5］。LAG3淋巴细胞活化蛋白3属于Ig超家族，包含4个细胞外Ig样结构域，8个外显子，并且LAG3与CD4有密切关系，LAG3是与癌症、传染病和自身免疫相关的重要免疫检查点。LAG3可以通过内吞作用和蛋白水解切割在转录和翻译后进行调节，并且LAG3与其配体存在相互作用［6］。通过生物信息学方法分析LAG3可能在AD中发挥的作用，对于AD的机制研究具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 数据下载 原始微阵列数据集从GEO数据库下载。GSE48350基于GPL570平台（HG-U133_Plus_2），由AD患者和健康人的死后大脑样本组成，海马区与AD具有密切联系，因此共计62例来自海马体的样本被用于进一步分析，其中19例为AD患者，43例为正常对照者。另一个数据集GSE140829包含204例AD患者血样和249例健康人的样本，检测基于HumanHT-12 v4 Expression BeadChip平台。正常对照组被命名为CTL，数据处理采用R软件包（version 4.0.3）［7］。利用R包Affy读取原始数据，然后进行鲁棒多芯片平均（RMA）算法归一化样本，确保每个样本具有可比性［8-9］。探针ID被转移到基因上根据平台标注命名。当一个基因对应于多个探针时，取各个探针ID的表达量中位数代表重复基因的表达。

1.2 免疫评分分析 将基因表达数据集使用标准的注释文件和数据上传到CIBERSORT网站（https：//cibersort.stanford.edu/），CIBERSORT是一种基于基因表达的反卷积算法［10］，对每个样本以CIBERSORT值P＜0.05为标准筛选，将过滤后的免疫细胞表达矩阵与GEO的信息矩阵融合，并对AD的免疫细胞进行评价。

1.3 GSEA分析 对于基因集功能富集分析［11］，课题组从GSEA中获得（http：//software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp），根据LAG3表达水平，将样本分为高表达组（≥50%）和低表达组（＜50%），获得分子签名数据库Kegg.V7.4。根据基因表达谱和表型分组，最小基因集设置为5，最大基因集设置为5 000，重复采样1 000次，P＜0.05，FDR＜0.25被认为差异有统计学意义。

1.4 PPI网络构建和KEGG/GO分析 PPI网络由蛋白通过彼此之间的相互作用构成，参与生物信号传递、基因表达调节、能量和物质代谢及细胞周期调控等生命过程的各个环节。网站最新版本为2019年1月19日发布的String 11.0［12-13］。对于基因集功能富集分析，课题组使用KEGG rest API（https：//www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html）获取了最新的KEGG Pathway的基因注释，以此作为背景，将基因映射到背景集合中，使用R软件包clusterProfiler（version 3.14.3）进行富集分析，以获得基因集富集的结果。设定最小基因集为5，最大基因集为5 000，P＜0.05和FDR＜0.25被认为差异有统计学意义。对于基因集功能富集分析，课题组使用R软件包org.Hs.eg.db（version 3.1.0）中的基因GO注释，以此作为背景，将基因映射到背景集合中，使用R软件包clusterProfiler（version 3.14.3）进行富集分析，以获得基因集富集的结果。设定最小基因集为5，最大基因集为5 000，P＜0.05和FDR＜0.25被认为差异有统计学意义。

1.5 AD细胞模型构建 Aβ1-42寡聚物制备淀粉样β-蛋白（1-42）购自上海碧云天生物技术有限公司，并根据参考文献［14］中的方法制备。简言之，将Aβ1-42悬浮在六氟异丙醇（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）中达到1 mmol/L，并在-80 ℃下作为干燥膜储存。将溶液放置在生物安全柜中以供HFIP挥发以形成肽膜，其重新悬浮在二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich）中，然后超声处理，在水浴中浸泡10 min。使用含有0.05%十二烷基硫酸钠的磷酸盐缓冲液（PBS）重新悬浮肽，然后在4 ℃下聚合2周，使用前用冷PBS进一步稀释至11.1 nmol/L。通过电子显微镜验证Aβ1-42的低聚物形式。在处理细胞之前，寡聚物溶液在4 ℃下13 000 r/min离心10 min。10 μmol/L为人源Aβ1-42浓度诱导小鼠海马神经元HT22细胞系24 h，作为AD的细胞模型。

1.6 LAG3水平检测 Real-time PCR检测细胞中mRNA水平，使用Trizol试剂提取HT22细胞中的总RNA后，进行Real-time PCR反应。反应体积为25 μl，反应体系含 SYBR Green Mix 12.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O 9.5 μl。反应条件为：95 ℃预加热10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火45 s，40个循环后，在60 ℃保持1 min，使产物延伸完整。数据采用仪器自带软件ABI Prism 7300 SDS Software分析各样本的Ct值，得出LAG3的mRNA水平。

1.7 统计学方法 使用R语言4.0.3版本，应用arrayImpute、arraryMissPattern软件包处理微阵列缺失值，因缺失数据很少，采用简单插补，即用均值来替换变量中的缺失值。使用barplot函数绘制其22种浸润免疫细胞的占比柱状图，应用pheatmap包分别分析和绘制免疫细胞表达热图，采用vioplot包绘制小提琴图，使用corrplot包绘制不同免疫细胞间的占比相关图。采用SPSS24.0统计软件对实验数据进行分析，计量资料采用±s表示。各组计量资料采用单因素方差分析，并用LSD-t法进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AD组织免疫细胞占比分析 如图1所示， 在AD组织中水平最高的10种免疫细胞类型分别是：M2型巨噬细胞、单核细胞、未活化的CD4+记忆性T细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、记忆B细胞、激活的树突状细胞、激活的肥大细胞、M0型巨噬细胞、γδ型T细胞。正常组织中水平最高的10种免疫细胞类型分别是：M2型巨噬细胞、未活化的CD4+记忆性T细胞、激活的肥大细胞、记忆B细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、激活的树突状细胞、γδ型T细胞、激活的NK细胞。

图1 GSE48350的免疫评分分析Fig.1 Immune score analysis of GSE48350

2.2 免疫细胞在AD组和正常对照组的比例差异与正常组织相比，AD组织中未激活的记忆CD4+T细胞和单核细胞的比例普遍较高，激活的NK细胞偏低（图2）。

图2 AD患者与健康人免疫细胞比较Fig.2 Comparison of immune cells between AD patients and normal controls

2.3 AD患者脑组织中和血液中的免疫检查位点分析 如图3、图4所示，在AD患者脑组织中位点CTLA4、HAVCR2、LAG3、SIGLEC5差异具有统计学意义（P＜0.05），AD患者的SIGLEC5水平低于健康人，其他位点水平均高于健康人。在AD患者的血液中LAG3的水平高于健康人，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图3 AD患者脑组织中的免疫检查位点基因表达Fig.3 Gene expression at immunoassay sites in brain tissues of AD patients

图4 AD患者血液中的免疫检查位点基因表达Fig.4 Immunoassay site gene expression in blood of patients with AD

2.4 细胞系验证 在人源Aβ1-42诱导的HT22细胞系中，LAG3的表达显著高于对照组（图5）。

图5 HT22细胞中LAG3的表达量Fig.5 Expression level of LAG3 in HT22 cells

2.5 基因富集分析 对AD患者脑组织中的LAG3进行GSEA分析发现，视黄醇代谢通路存在显著差异（图6）。

图6 AD患者脑组织LAG3基因的GSEA分析Fig.6 GSEA analysis of LAG3 gene in brain tissue of AD patients

2.6 PPI及KEGG/GO分析 对LAG3进行PPI网络分析（图7）发现，LAG3与CD274、TIGIT、CD4、CTLA4、PDCD1、HAVCR2、CLEC4G、LGALS3、SNCA、FGL1存在相互联系。然后对所有基因进行KEGG和GO分析（图8）发现，这些基因主要参与细胞黏附分子（cellular adhesion molecules，CAMs）、PD-L1表达和PD-1检查点通路、癌症细胞受体信号通路、原发性免疫缺陷、自身免疫性甲状腺疾病、抗原加工和呈递、Th1和Th2细胞分化、类风湿关节炎、造血细胞系Th17细胞分化等通路。GO分析发现这些基因与白细胞活化的调节、白细胞细胞黏附的调节、细胞激活的调节、T细胞活化的调节、白细胞黏附和信息传递、T细胞活化的负调控、细胞黏附的调节、淋巴细胞活化的调节、白细胞细胞与细胞黏附的负调控、T细胞激活等功能有关。

图7 LAG3的PPI网络分析Fig.7 PPI network analysis of LAG3

图8 LAG3相关基因KEGG和GO分析图Fig.8 KEGG and GO analysis of LAG3-related genes

3 讨论

免疫细胞在AD的发生及发展过程中发挥重要作用，已知参与AD的免疫细胞主要有小胶质细胞、巨噬细胞、肥大细胞、T细胞等［15］。通过对AD患者脑组织的测序结果进行免疫细胞分析发现，与正常组织相比，AD患者脑组织中未激活的记忆CD4+T细胞和单核细胞的比例普遍较高，激活的NK细胞偏低。CD4+T细胞包括Th1、Th2、Th17等多种亚型，Th1细胞导致小胶质细胞活化和Aβ沉积增加，还可以通过激活巨噬细胞和CD8+T细胞进一步加重［16］。还有研究表明，NK细胞的耗竭可改善AD小鼠模型的认知功能［17］。随后课题组对AD患者的脑组织和血液中与免疫相关的检查位点进行了分析，发现LAG3在AD患者中存在差异，同时课题组利用AD细胞模型对这个结论进行了验证，已知LAG3与CD4细胞存在联系［6］，这就与AD患者CD4细胞升高相互印证。为了深入分析LAG3的生物学功能，课题组对其进行了GSEA分析和PPI网络构建，并对网络中的基因进行了KEGG和GO分析，GSEA分析显示LAG3与视黄醇的代谢通路有关，视黄醇被运送到髓系细胞转化为视黄酸，关键受体是LRP1，并且该轴对肠道先天和适应性免疫反应至关重要［18］。PPI网络分析发现了与其相互作用的10个基因，KEGG分析发现其主要与CAMs、原发性免疫缺陷等通路有关，GO分析发现其主要与白细胞和T细胞活化以及调节有关。这些通路均与免疫反应有关，说明LAG3在免疫功能中可能发挥重要作用。

总之，本研究应用生物信息学分析技术，基于CIBERSORT等研究方法，分析了AD患者与健康人免疫细胞的差别，并对免疫检查位点LAG3进行了生物功能预测。本研究结果表明，未激活的记忆CD4+T细胞、单核细胞以及激活的NK细胞与AD的发生存在联系，这些免疫特征可能是影响AD治疗效果的主要因素，也是未来评估AD的新的参考指标。