镉污染对滨海滩涂围垦区西兰花根际土壤细菌群落结构的影响

陈海生，陈韬略，蔡林生，李若华，罗 文，高永胜，李振宇，裴孝钟，王 雪

（1.浙江同济科技职业学院，杭州 31123；2.浙江农林大学数学与计算机学院，杭州 311300）

近年来，土壤重金属污染已成为严重的环境问题，对作物生产、粮食安全和人类健康构成巨大威胁。镉（Cd）是一种人体非必需的元素，具有潜在的“致癌、致畸、致突变”效应，极易通过食物链进入人体从而伤害人体健康[1]。由于工业“三废”的日渐增多和含Cd肥料大量使用，大量的重金属Cd进入土壤后导致土壤中Cd污染日趋严重。由于其在环境中具有潜在的毒性和高流动性，使其成为重金属中毒性最大、分布最广泛的污染物之一[2]。其中蔬菜受重金属Cd污染的情况日益严重，Cd污染严重的土壤会抑制蔬菜的生长发育导致蔬菜作物减产和蔬菜可食部分Cd含量超标[3]。因此，对Cd污染蔬菜农田土壤的修复变得十分重要[4-5]。

农田土壤微生物是农田生态系统最活跃的部分，在促进土壤养分循环、维持生态系统平衡方面起着重要作用。微生物群落结构和多样性指数能够直接反映农田土壤的污染程度，其对环境条件的变化响应灵敏，能够真实评估各种污染物对农田生态系统的危害程度[6]。高通量测序能同时大批量对土壤样品微生物的优势菌群、稀有物种等进行检测[7]。DUAN 等[8]采用高通量测序技术研究了不同浓度Cd污染对我国东北普通始成土细菌群落结构和多样性的影响，发现高浓度的Cd能提高农田土壤细菌群落的丰富度和多样性指数，罗尔斯通菌属（Ralstonia）、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、根微菌属（Rhizomicrobium）和阿菲波菌属（Afipia）是高抗Cd 污染的细菌菌属。GUO 等[9-10]采用高通量测序技术研究了陕西省商洛市被镉（Cd）、铅(Pb)和锌(Zn)污染的农田土壤的细菌群落结构，发现了对这些重金属敏感的细菌菌属如罗尔斯通菌属（Ralstonia）、芽单胞菌属（Gemmatimona）、罗思河小杆菌属（Rhodanobacter）、水恒杆菌属（Mizugakiibacter）。赵立君等[11]研究了砷(As)污染湿地土壤细菌多样性及群落结构特征，发现细菌群落对As污染具有较为敏感的响应，在As浓度为400 mg·kg-1时存在大量的假单胞菌科（Pseudomonas），可为As 污染湿地微生物修复提供借鉴。但关于Cd 污染条件下滨海滩涂围垦区土壤细菌群落结构特征的研究报道并不多见。

西兰花(Brassica oleracea var.italica)为十字花科芸薹属蔬菜，其原产地为欧洲。色泽深绿，因其口味独特、营养全面，深受消费者喜爱[12]。西兰花是我国在国际市场上比较有竞争力的蔬菜品种[13-14]，其作为浙江省的特色蔬菜，主要分布在浙江省沿海滩涂围垦区。本研究利用Miseq测序平台采用高通量测序技术分析不同浓度Cd 污染条件下滨海滩涂湿地围垦区西兰花根际土壤细菌群落结构组成及多样性指数变化特征，研究Cd污染对土壤细菌群落结构影响规律，并探索有利于Cd污染修复的抗Cd细菌菌群，以期为我国滨海滩涂地西兰花重金属污染土壤微生物修复提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设置

试验所用土壤采用浙江省临海市上盘镇磊石坑村西兰花种植基地土壤(表层0~20 cm)，底质为黏泥沙质，成土母质为新浅海沉积物。土壤pH 值为7.48，有机质(Organic matter)含量为15.52 g·kg-1，土壤盐分含量为0.11%,全氮(Total N)0.98 g·kg-1，有效磷(Available P)105.13 mg·kg-1，速效钾(Available K)257.05 mg·kg-1。先把土样自然晾干，再进行粉碎，过2 mm 尼龙筛。取10 kg 土样置于培养盆内，试验用盆规格为：内口径44 cm，底径32 cm，高32 cm。共设置3个Cd污染浓度梯度，分别是0，3.5，60 mg·kg-1，依次标记为Cd0、Cd3.5、Cd60组。具体做法是将CdCl2·2.5H2O按照0，3.5，60 mg·kg-1的浓度梯度（浓度以纯Cd 计，Cd 的起始浓度参考国家土壤环境质量二级标准）配成水溶液，均匀浇灌于盆土中(渗出液反复回收浇灌，直到Cd 离子与盆栽土壤均匀混合)，以浇清水作对照为Cd0，每个处理5 次重复[15]。其中Cd3.5为我国受重金属污染较严重地区土壤Cd污染浓度的平均值[16]。于2022年4月10日选取生长旺盛且大小均匀一致的西兰花幼苗种植到试验盆里。每个试验盆内栽植5 株西兰花幼苗，每个处理重复3 个平衡试验。全部试验用盆置于浙江省台州农业科学院人工气候室内，肥水管理和其他措施包括除草等均一致。培养3 个月后进行土样取样，取样前先让试验盆自然落干，在土壤表层0~10 cm处采集直径小于0.1 cm各植株细根，用抖落法[17-18]收集黏附在植株细根上的土壤作为西兰花根际土壤样品，取土样时进行3次重复，将土样混合均匀、去杂和过筛后，取10 g土样置于冰盆内直接寄往杭州联川生物公司。

1.2 土壤细菌高通量测序

采用E.Z.N.A.Soil DNA Kit 试剂盒(D5625,Omega,Inc.,USA)提取土样的总DNA。使用上下引物分别为341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)，对16S rDNA基因的(V3-V4)进行PCR扩增。PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶泳进行检测，并对目标片段进行切胶回收，回收采用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒。测序在Illumina Miseq PE300平台上进行。

1.3 生物信息处理

根据Barcode序列拆分各样品数据，然后使用FLASH 对截取Barcode和引物的序列进行拼接[19]；采用根据fqtrim（v0.94）对原始序列进行过滤、拼接和嵌合体去除[20]，以获得高质量的clean 标签。使用Vsearch 软件对嵌合序列进行过滤（v2.3.4）。根据SILVA（release 132）分类器，利用每个样本的相对丰度对特征丰度进行归一化。利用QIIME2 软件分别对每个样本计算细菌的Alpha 多样性指数。采用Blast 进行序列比对，每个代表性序列用SILVA 数据库对特征序列进行注释。其他图使用R 包实现（v3.5.2）。所得到的数据用SPSS 16.0进行统计和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 Cd污染条件下西兰花根际土壤细菌多样性特征

Miseq 测序所得土壤样品经质检后，获得了各处理样品的细菌有效序列数。由表1 可知，西兰花根际土壤细菌有效序列以Cd3.5 即Cd 浓度为3.5 mg·kg-1的处理组为最高，其次是Cd60 即Cd 浓度为60 mg·kg-1的处理组，而以对照组即不设Cd 污染的西兰花根际土壤细菌有效序列最低。各处理及对照的有效序列比例均大于71%。序列长度在400~500 bp 和300~400 bp 的分别占99.90%和0.08%，总计大于99.98%，符合分析要求。

表1 不同程度Cd污染西兰花根际土壤细菌有效序列读数及OTUs数Table 1 The sequence readings and OTUs of soil bacterial of rhizosphere of broccoli under different gradients of cadmium contamination

经质控和去除嵌合体后，所得有效序列以97%的一致性聚类成OTUs，各处理及对照组的OTUs数为419~1 687 个，共计2 577 个。其中以Cd3.5 即Cd浓度为3.5 mg·kg-1的样品OTUs数最多,为1 687个，其次是对照组样品，OTUs 数为1 065 个，而以Cd60组样品的OTUs 数最少，只有419 个。这三者之间的差异均达显著水平（p<0.05）。

不同Cd 浓度污染下西兰花根际土壤细菌共有的OTUs 数是96 个，占总数的3.73%；Cd3.5 组样品特有的细菌OTUs 数为1 216 个，占总数的47.18%；Cd60 组样品特有的细菌OTUs 数为229 个，占总数的8.89%；而对照组Cd0样品特有的细菌OTUs数为634 个，占总数的24.60%。Cd3.5 组样品土壤细菌特有OTUs 数比对照增加191.80%，而Cd60 组样品土壤细菌特有OTUs数比对照减少63.88%（图1）。

土壤微生物Chao1 指数和Shannon 指数用来表示其丰富度和多样性。由表2 可知，不同程度Cd污染对西兰花根际土壤细菌Chao1 指数和Shannon指数的影响程度是不同的。Chao1 指数和Shannon指数均以Cd3.5 处理组样品为最高，其值分别为1 623.31和9.26，比对照的1 029.12和8.37分别增加57.74%和10.63%，而Cd60处理组样品的Chao1指数和Shannon 指数下降至403.02 和6.93，分别比对照降低60.85%和17.21%，3 个处理的差异程度均达显著水平(p<0.05)。

表2 不同程度Cd污染西兰花根际土壤细菌Alpha多样性指数Table 2 Alpha diversity in soil bacterial communities of rhizosphere soils of broccoli under different gradi‐ents of cadmium contamination

2.2 Cd污染对西兰花根际土壤细菌群落结构在门水平上组成的影响

通过对测序结果的物种注释，各处理组土壤样品中所检测到的细菌菌群分属于35 门、97 纲、205目、315 科、506 属。在门水平上，各处理组土壤细菌群落组成均以变形菌门(Proteobacteria，48.26%~60.38%)为主，其次是放线菌门(Actinobacteria，4.78%~19.50%)，其他占比较大的还有酸杆菌门(Acidobacteria，3.56%~10.31%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，4.24%~8.54%)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，3.21%~4.88%)、髌骨菌门(Patescibacteria，1.02%~8.57%)、绿湾菌门(Chloroflexi，2.62%~4.60%)、棒状杆菌门(Rokubacteria，2.37%~3.14%)、浮霉菌门(Planctomycetes，0.77%~3.38%)、疣微菌门(Verrucomicrobia，1.27%~2.56%)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae，0.70%~1.48%)、厚壁菌门(Firmicutes，0.20%~1.62%)。

不同程度Cd 污染条件下，西兰花根际土壤细菌群落组成在门水平上发生了明显的变化。由图2可知，在门水平上，未经Cd污染处理的Cd0组土壤变形菌门的相对丰度为48.92%，经Cd3.5组处理后，变形菌门的相对丰度稍有下降，但与Cd0相比差异不显著(p>0.05)。当Cd浓度增加到60 mg·kg-1时，土壤变形菌门的相对丰度增加到60.38%，增加23.43%，与Cd0 和Cd3.5 组的差异均达显著水平(p<0.05)。土壤放线菌门的相对丰度随着Cd浓度的上升呈下降趋势，Cd3.5组比Cd0组下降30.62%，其差异达极显著水平(p<0.01)，Cd60组比Cd0组下降75.49%，其差异达极显著水平(p<0.01)。土壤酸杆菌门的相对丰度在低浓度Cd污染时呈上升趋势，在Cd3.5组样品其相对丰度比Cd0时增加30.34%，其差异程度达极显著水平(p<0.01)，而在高浓度Cd 污染时呈下降趋势，Cd60组样品酸杆菌门相对丰度比Cd0时降低54.99%，其差异达极显著水平(p<0.01)。土壤拟杆菌门的相对丰度在低浓度Cd 污染时上升幅度不大，与对照差异未达显著水平(p>0.05)，而在高浓度Cd 污染时上升幅度较大，比对照Cd0 增加101.42%，其差异达极显著水平(p<0.01)。土壤芽单胞菌门的相对丰度也随着Cd污染程度的加剧而呈升高的趋势，Cd60 组的比对照升高52.03%，其差异达显著水平(p<0.05)。土壤绿湾菌门的相对丰度在低浓度Cd 污染时呈上升趋势，Cd3.5 组样品其相对丰度比对照Cd0 组增加27.42%，其差异达极显著水平(p<0.01)，在高浓度Cd 污染时呈下降趋势，Cd60 组样品其相对丰度比对照Cd0 组的下降27.42%，其差异达极显著水平(p<0.01)。棒状杆菌门的相对丰度在低浓度Cd 污染时呈上升趋势，Cd3.5 组比Cd0 组增加30.83%，差异程度达极显著水平(p<0.01)，而在高浓度Cd 污染时呈下降趋势，但Cd60 组与对照Cd0 相比差异未达显著水平(p>0.05)。浮霉菌门的相对丰度随着Cd 污染程度的加剧一直呈下降趋势，在Cd 3.5 时下降26.33%，其差异达极显著水平(p<0.01)，而到Cd60 时下降77.22%，其差异达极显著水平(p<0.01)。土壤疣微菌门的相对丰度在低浓度Cd 污染时呈上升趋势，Cd3.5 组样品其相对丰度比对照虽有增加，但差异未达显著水平(p>0.05)，在高浓度Cd 污染时呈下降趋势，Cd60 组样品其相对丰度比对照降低45.02%，其差异达极显著水平(p<0.01)。土壤硝化螺旋菌门和厚壁菌门的相对丰度也呈同样的趋势，在低浓度Cd污染时其相对丰度分别比对照增加37.04%和110.39%，并且差异均达极显著水平(p<0.01)，而在高浓度Cd污染时其相对丰度呈急剧下降趋势，分别比对照降低35.19%和74.03%，其差异均达极显著水平(p<0.01)。

图2 门水平上不同浓度Cd污染条件下西兰花根际土壤细菌群落结构Figure 2 The bacterial communities at phylum level in rhizosphere soils of broccoli under different gradients of cadmium contamination

2.3 Cd污染对西兰花根际土壤细菌群落结构在属水平上组成的影响

在属水平上，各处理组土壤样品中细菌群落均以罗思河小杆菌属(Rhodanobacter,4.52%~21.25%)为主，其次为鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas，2.45%~4.83%)、马赛菌属(Massilia，1.59%~4.03%)、未分类的噬几丁质科(Chitinophagaceae-unclassified，1.42%~2.56%), 其他相对丰度较大的还有假节杆菌属（Pseudarthrobacter，0.36%~3.22%)、未分类的α-变形菌(Alphaproteobacteria-unclassified，1.07%~2.08%)、黏液杆菌属(Muciaginibacter，0.97%~2.12%)、慢生根廇菌属(Bradyrhizobium，1.08%~1.54%)、链霉菌属(Streptomyces，0.18%~1.86%)、黄杆菌属(Flavobacterium，0.20%~2.78%)、杜擀氏菌属(Duganella，0.62%~1.49%)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas，0.46%~1.87%)、硝化螺旋菌属(Nitrospira，0.70%~1.32%)、亚硝化螺菌属(Nitrosospira，0.49%~1.06%)、中慢生根廇菌属(Mesorhizobium，0.73%~0.91%)、火山岩海球菌属(Marmoricola，0.63%~0.82%)、诺卡氏菌属(Nocardioides，0.19%~1.27%)。

不同程度Cd 污染条件下，西兰花根际土壤细菌群落结构在属水平上发生了明显变化。由图3 可知，未经Cd污染处理的土样罗思河小杆菌属相对丰度为8.84%，经Cd3.5组处理后，其相对丰度大幅度下降，下降幅度为48.87%，其差异达极显著水平(p<0.01)。当Cd浓度增加到60 mg·kg-1时，土壤罗思河小杆菌属相对丰度增加到21.25%，增加140.38%，其差异达极显著水平(p<0.01)。土壤鞘氨醇单胞菌属的相对丰度在低浓度Cd 污染时呈上升趋势，但上升幅度只有5.69%，与对照的差异程度不明显，在高浓度Cd污染时呈下降趋势，下降幅度达46.39%，其差异程度达极显著水平(p<0.01)。土壤假节杆菌属、黏液杆菌属以及红假单胞菌属的相对丰度随着Cd浓度的增加一直呈下降趋势。土壤黄杆菌属的相对丰度随着Cd污染程度的加剧呈一直升高的趋势，其Cd60组的相对丰度比对照增加1290.00%，其差异达极显著水平(p<0.01)。

图3 属水平上不同浓度Cd污染条件下西兰花根际土壤细菌群落结构Figure 3 The bacterial communities at genus level in rhizosphere soils of broccoli under different gradients of cadmium contamination

3 讨论与结论

曾经有学者认为，重金属污染会对土壤微生物多样性的变化产生影响，随着污染的加重，土壤微生物多样性会出现拱桥形的变化趋势[21]。当重金属污染剂量较低时，会产生抑制优势种群的竞争性排除效应，而促进劣势种群的生长和繁殖，导致微生物多样性升高。而重金属污染剂量较高时，会对微生物产生毒性，某些造成微生物物种消亡，而致使微生物多样性下降。邢奕等[22]研究了密云水库上游铁矿区重金属污染对土壤微生物群落的影响，发现细菌、放线菌的种群多样性水平随着重金属污染程度的加强呈先上升再下降的趋势。郑涵等[23]的研究发现低浓度Zn 胁迫(200 mg·kg-1)促进微生物群落数量的增加，提高了群落结构多样性，而高浓度Zn胁迫(>800 mg·kg-1)时，较重程度的锌胁迫对微生物产生了明显的抑制作用。赵立君等[11]研究了砷(As)胁迫对湿地生境下土壤微生物生物多样性及群落结构特征，发现低浓度砷(As)胁迫会在一定程度上刺激As敏感微生物的生长繁殖，造成微生物多样性增加，而高浓度As胁迫会对微生物产生明显的抑制作用，导致某些物种消亡而微生物多样性下降。本研究在滨海滩涂湿地围垦区西兰花根际土壤上的研究也表明了低浓度Cd 污染时西兰花根际土壤细菌Chao1 指数和Shannon 指数与对照相比大幅度上升(p<0.01)，而高浓度Cd 污染时西兰花根际土壤细菌Chao1 指数和Shannon 指数大幅度下降(p<0.01)。各样品土壤细菌特有的OTUs 数变化也呈同样的趋势(p<0.01)，即低浓度Cd污染时土壤细菌特有的OTUs数与对照相比呈大幅度增加趋势，而在高浓度Cd污染时土壤细菌特有的OTUs数与对照相比呈大幅度减少趋势(p<0.01)。本研究结果与上述学者的结论一致。

赵立君等[11]在研究砷污染湿地生境下土壤细菌群落结构特征时检测到，在高浓度砷（As）污染条件下，土壤变形菌门的相对丰度为75.00%，而厚壁菌门的相对丰度只有7.00%。本研究结果也表明了在高浓度Cd 污染下土壤变形菌门的相对丰度升高至60.38%，而厚壁菌门的相对丰度下降至0.20%，这说明土壤变形菌门是能够在高浓度Cd 污染条件下生存下来的耐Cd 微生物，并能成为土壤细菌群落的主导，这一点与赵立君等[11]的研究结果相一致。另外，土壤酸杆菌门、绿湾菌门、疣微菌门、硝化螺旋菌门、棒状杆菌门在低浓度Cd 污染时其相对丰度增加，而在高浓度Cd 污染时其相对丰度降低，说明在这些菌门中可能存在大量的对Cd 敏感的细菌群落在Cd 刺激下大量出现，而随着Cd 浓度的升高，Cd对土壤细菌产生毒性，大量对Cd敏感的细菌逐渐消失，而使群落结构趋于单一、稳定。

Cd 污染使滨海滩涂湿地围垦区西兰花根际土壤细菌群落结构在门水平上发生了变化。随着Cd污染程度的加重，农田土壤放线菌门和浮霉菌门的相对丰度呈一直下降的趋势，拟杆菌门和芽单胞菌门的相对丰度呈一直升高的趋势，土壤变形菌门和髌骨菌门的相对丰度则呈先下降后上升的趋势。而酸杆菌门、棒状杆菌门、疣微菌门、硝化螺旋菌门和厚壁菌门的相对丰度均呈先上升后下降的趋势，说明这5个菌门中可能存在大量对Cd敏感的菌群，在Cd的刺激下大量出现，群落结构变得复杂多样，导致这些菌群的相对丰度上升。而当Cd 污染程度继续加重时，这些菌门的相对丰度呈下降趋势，这说明随着Cd 污染程度的增强，Cd 对土壤细菌产生了毒性，大量对Cd 敏感的细菌不断消失，而使变形菌门、拟杆菌门、髌骨菌门、芽单胞菌门这些能够在高浓度Cd 污染环境下能够生存下来的耐Cd 细菌门成为农田土壤细菌的主体。

不同程度Cd污染条件下，西兰花根际土壤细菌群落结构在属水平上发生了明显变化。土壤罗思河小杆菌属相对丰度在低浓度Cd 污染时呈下降趋势，而在高浓度Cd 污染时呈升高趋势，土壤鞘氨醇单胞菌属的相对丰度在低浓度Cd 污染时呈上升趋势，在高浓度Cd 污染时呈下降趋势。土壤假节杆菌属、黏液杆菌属以及红假单胞菌属的相对丰度随着Cd浓度的增加一直呈下降趋势。土壤黄杆菌属的相对丰度随着Cd 污染程度的加剧呈一直升高的趋势。在高浓度Cd 污染处理下，西兰花根际土壤细菌群落结构趋于简单、稳定，耐Cd 的细菌菌群占据主导地位。在高浓度Cd 污染处理下在属水平上仍然具有高丰度的菌群有罗思河小杆菌属，以及Gemmatimonadaceae-unclassified、马赛菌属、Candidatus-Adlerbacteria-unclassified、Chitinophagaceae-unclassified、Alphaproteobacteria-unclass、黄杆菌属、杜擀氏菌属，这些菌属可以被认为是在滨海滩涂湿地西兰花种植田土壤上高抗Cd污染的细菌菌群。