黄芩治疗慢性鼻窦炎网络药理学作用机制研究*

侯青雯，王旭，姚斌峰，李敏

1 苏州市中西医结合医院，江苏 苏州 215101； 2 南京市中西医结合医院，江苏 南京 210014

慢性鼻窦炎（chronic rhinosinusitis，CRS）是耳鼻咽喉头颈外科的常见病和多发病，是鼻腔及鼻窦黏膜的慢性炎症性疾病。流行病学调查发现，我国CRS的平均患病率约为8.0%，其中15～75岁年龄段人群患病率为8.2%，已成为影响人们健康的常见慢性疾病之一［1］。目前，西医治疗CRS通常以糖皮质激素、大环内酯类药物及抗菌药物为主，但这些治疗方式无法很好改善症状，患者最终选择鼻内镜手术［2］。而外科手术存在创伤大，危险因素及并发症多等问题，因此探究安全有效治疗CRS的药物成为目前研究的新方向。

CRS属中医“鼻渊”范畴，以鼻流浊涕、量多不止、鼻塞声重、头痛头昏、嗅觉减退为主要临床特征［3-4］。古代医家根据《素问·气厥论篇》中“胆移热于脑，则辛鼻渊，鼻渊者，浊涕下不止也”的论述，提出鼻渊病因病机的基础在于“胆热”，故临床治疗多从胆热出发，以清胆通窍为主。黄芩为唇形科黄芩属植物黄芩的干燥根，性寒、味苦，归肺、心、肝、大肠经，善清泄少阳胆腑邪热［5］。研究发现，多数治疗CRS经验方中均含有黄芩，而且黄芩大量应用于鼻科疾病的临床治疗［6］，但是对于黄芩治疗CRS的机制尚无深入研究。本研究基于网络药理学方法，分析黄芩治疗CRS可能的作用机制，以期为CRS的实验及临床研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 黄芩活性成分筛选以“黄芩”为关键词，检索中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP；http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）搜集黄芩活性成分［7］，建立黄芩活性成分数据库。根据活性成分的药动学参数（吸收、分布、代谢及排泄）筛选符合条件的活性成分，筛选条件为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（druglikeness，DL）≥0.18。

1.2 黄芩活性成分2D结构查询针对所筛选黄芩活性成分，利用PubChem（https：//pubchemncbi.nlm.nih.gov/）数据库［8］，以收集活性成分的PubChem Cid为检索条件，检索并将活性成分名称标准化，保存每个活性成分的2D结构（SDF格式）。

1.3 黄芩活性成分靶点预测采用Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）服务器［9］，依次上传黄芩活性成分2D结构（SDF格式），进行反向药效团匹配，点击Predict targets，获取与黄芩活性成分相关的靶点蛋白。通过UniPort数据库（http：//www.uniprt.org/）进行靶点-基因名转换并筛选出物种为“人”的靶点，即为黄芩主要活性成分预测靶点。

1.4 CRS疾病靶点筛选通过人类基因数据库（the human gene database，GeneCards；https：//www.genecards.org/）、在线人类孟德尔遗传数据库（online mendelian inheritance in man，OMIM；http：//www.omim.org/）、DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）数据库，以“Chronic rhinosinusitis”进行检索，分别获取人CRS相关基因和蛋白靶点信息；应用UniPort数据库对纳入的靶点进行靶点-人类基因名转换。整理合并转换后的数据，删除重复值（相同基因简称及蛋白靶点信息），得到包括基因、对应靶点名称及蛋白质编号的Excel文件。

1.5 CRS靶点的蛋白-蛋白互作网络（proteinprotein interactions，PPl）构建将上述靶基因取交集；将共同靶基因上传到STRING平台（https：//stringdb.org/）［10］获取PPI数据。打开STRING页面，选择“Multiple proteins”，将黄芩预测靶点与CRS疾病靶点基因复制到“List of Names”中，“Organism”中选择“Homo sapiens”，其余参数保持默认状态，构建黄芩治疗CRS潜在靶点之间的PPI网络。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析将共同靶标基因名输入核心靶基因，导入基因功能注释数据库（the database for annotation visualization and integrated discovery，DAVID；https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）在线分析工具［11］，选择GO富集及KEGG通路富集分析功能，通过R语言包构建KEGG通路富集分析中筛选的关键信号通路条形图。

2 结果

2.1 黄芩活性化合物成分经TCMSP数据库检索，共得到143种黄芩活性成分，筛选后得到36个潜在活性成分，其基本信息见表1。

表1 黄芩活性成分和靶点筛选结果（排名前36）

2.2 黄芩治疗CRS的潜在作用靶点共检索出36个黄芩活性成分潜在相关靶点，2555个蛋白靶点，去除重复靶点后得到黄芩活性成分预测靶点445个。人类CRS相关疾病靶点共1240个，合并去重后获得CRS疾病靶点1133个。通过Venny 2.1在线平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）与Swiss Target Prediction数据库对预测靶点取交集，得到共同靶点129个，即为黄芩治疗CRS潜在靶点。见图1。

图1 黄芩活性成分-CRS相关靶点韦恩图

2.3 “药物-活性成分-疾病-靶标”网络“药物-活性成分-疾病-靶标”网络中共有167个节点和1001条边。图中红色正方形代表黄芩，绿色正方形代表疾病CRS，黄色菱形代表活性成分，黄色正六边形代表靶点基因，边代表黄芩活性成分与CRS靶点基因之间的相互关联。该网络中节点反应度值大小，线条个数与靶点作用因素成正比。提示该活性成分或靶点可能是网络的关键，并发挥着关键作用。见图2。

图2 “药物-活性成分-靶标-疾病”网络

2.4 PPl网络PPI网络中包含128个靶蛋白节点，1756条相互作用连线。连接度即度值是指PPI网络中节点所通过的边的个数。度值越大代表此节点与其他节点的关系更紧密，在网络中所处地位越重要。以“节点连接度”的中位数为卡值，选取中药靶标-疾病基因互作网络的核心节点，同时以度中心性、接近中心性和中介中心性的中位数为卡值，进行两次筛选，得到靠前的10个靶点蛋白网络，包含10个节点和45条边。图中节点代表蛋白，节点连接边的个数越多，代表该节点的度越大。图中边代表蛋白之间相互作用强弱，边越粗代表蛋白之间的相互作用越强。该网络中度值最高的靶蛋白为GAPDH，度值为100，其次为Akt1、CASP3、TNF、STAT3、EGFR、SRC、HSP90AA1、MAPK8、PTGS2，这些靶蛋白与其他蛋白相互作用，在该网络中发挥了关键作用。这些度值较高的靶蛋白可能是黄芩治疗CRS的关键靶点。见图3—4。

图4 黄芩治疗CRS关键靶点

2.5 GO和KEGG通路富集分析GO富集分析中，根据P值（P＜0.05）筛选出353个生物过程，其中信号转导、凋亡过程负调控、RNA聚合酶Ⅱ促进剂转录的正调控、蛋白质磷酸化，药物应答、细胞增殖正调控、炎性反应、肽基酪氨酸磷酸化、细胞增殖、蛋白质自磷酸化等位于GO生物过程前列。可见，CRS的发生发展涉及炎症反应调节、蛋白质磷酸化、细胞增殖与凋亡的调节等生物过程，而黄芩可通过调节以上生物过程治疗CRS。KEGG通路富集分析，根据P值（P＜0.05）共得到70条通路。去除胰腺癌、丙型病毒型肝炎、急性粒细胞白血病、麻疹等具体疾病及其他无关条目后，得到48条通路，核心通路主要包括PI3K/Akt、RAS、Rap1、趋化因子、TNF、FoxO、HIF-1等信号通路。见图5—6。

图5 黄芩治疗慢性鼻窦炎GO富集分析

图 6 黄芩治疗慢性鼻窦炎KEGG通路富集分析

3 讨论

随着现代医学对CRS的深入研究，发现运用中药及其有效成分治疗CRS疗效确切。现代药理学研究发现，黄芩及其有效成分具有解热、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫等作用［12-15］。

本研究共筛选出黄芩素、红花素、黄烷酮、降钙素、黄连碱、豆甾醇等的36个黄芩主要活性成分及其预测靶点445个，CRS潜在靶点1133个，黄芩治疗CRS的靶标129个。研究发现，黄芩素具有抗炎、抗病毒、抗氧化、减弱肺组织细胞凋亡等药理作用［16］。张洺嘉等［17］发现黄芩素可降低ica A和cid A基因表达，对细胞间多糖黏附素的合成和胞外DNA的释放产生影响，进而抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成。金黄色葡萄球菌生物膜的形成与CRS的发生、发展密切相关，相关研究［18-19］通过体外实验证实金黄色葡萄球菌内毒素B可引起CRS伴鼻息肉患者鼻腔黏膜组织发生Th2/Th17炎症反应，释放相关炎症因子，引起鼻窦黏膜局部产生慢性持续性炎症。黄芩的另一活性成分黄连碱具有抗菌、抗病毒作用［20］，陈汉斌等［21］在小鼠体内发现黄连碱可不同程度减低白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）含量，减少IL-1β和TNF-α的mRNA表达。相关实验证实，CRS患者外周血中IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2高表达［22-24］。黄连碱可以通过降低IL-1β、IL-6、PGE2和TNF-α含量治疗CRS。上述研究与本研究结果相似，提示黄芩及其有效成分具有一定的治疗CRS作用。

本研究发现，黄芩治疗CRS的核心靶点Akt1、CASP3、TNF、STAT3、EGFR、SRC、HSP90AA1、MAPK8、PTGS2与CRS关系密切，可能是黄芩治疗CRS的主要靶点。研究发现TNF主要由单核巨噬细胞及激活淋巴细胞产生，是一种广谱促炎症活性细胞因子，TNF过量表达可诱导嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等黏附在鼻黏膜内皮表面，损伤鼻黏膜［25］。CAO等［26］发现CRSwNP患者的上皮层存在着STAT3以及STAT3磷酸化形式的表达，表明其参与了CRS的病理过程。有文献报道表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）参与了气道慢性炎性过程，EGFR在上气道黏膜上皮细胞的表达失衡，影响了鼻窦炎症患者鼻黏膜正常修复过程［27］。MAPK8的激活可控制HTR-8/SVneo细胞侵袭，进而影响基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）表达，而MMP表达失衡对细胞外基质的生成与降解起作用，影响CRS组织重塑过程［28-29］。

本研究将得到的靶蛋白导入DAVID数据库，得到了排名前10的信号通路，综合有关CRS信号通路文献发现，PI3K/Akt信号通路参与了CRS的发病［30］。与PI3K/Akt信号通路关联的核心靶点EGFR是一种跨膜糖蛋白，为人类表皮生长因子受体家族酪氨酸受体中的一员，当EGFR配基化形成二聚体后可直接激活细胞内区域激酶活性，引发细胞内一系列反应，激活PI3K［31］，PI3K激活后在其质膜上产生第二信使PIP3［32］，PIP3与PDK1结合，促使AKT的Thr308位点产生磷酸化，导致Akt活化，从而激活下游PI3K/Akt信号通路［33-34］，PI3K/Akt信号通路可通过激活其下游因子GSK3β，参与细胞周期和细胞凋亡等过程的调节。相关研究证实在CRS伴鼻息肉组中GSK3β蛋白表达及基因表达升高，GSK-3β参与CRS的炎症和息肉过程的PI3K/Akt信号通路［35］，成为PI3K/Akt信号通路的作用点，从而发挥治疗CRS的作用。

本研究应用网络药理学方法对黄芩治疗CRS的潜在活性成分、作用靶点、生物通路等进行了系统研究和分析。结果显示，黄芩可能通过PI3K/Akt等信号通路发挥治疗CRS的作用，为进一步研究黄芩作用机制提供了参考，但黄芩治疗CRS的具体作用机制仍需通过实验加以验证。