基于网络药理学探讨参蛭通心胶囊核心药对人参-水蛭治疗扩张型心肌病的作用机制*

齐璐瑶，邢基祥，范吉林，侯信铮，陈昭，张世亮

1 山东中医药大学，山东 济南 250014； 2 山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014

扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）是一种由不同病因引起的异质性心肌病，以心脏扩大、射血分数降低为主要临床表现，后期常发展为心律失常、心衰、血栓栓塞甚至猝死［1］。西医多采用心室减容、心脏再同步方法治疗，后期选择心脏移植。近年来西药治疗DCM虽然取得一定进展，但预后仍较差。有研究表明，DCM患者5年病死率约为42.24%［2］。

人参-水蛭是张世亮教授创制的治疗胸痹、心悸等气虚血瘀证的代表方参蛭通心胶囊的核心药对，临床观察发现该药在增强心肌收缩功能、改善心衰、对抗心律失常、预防血栓栓塞和猝死等方面具有重要作用。人参为补益气血要药，人参中的多种人参皂苷和人参多糖被现代药理证实具有增强心肌收缩、提升动脉血流量、对抗休克发作及心律失常、降脂、抗动脉硬化、抑制血栓形成等作用。水蛭可破瘀通闭，行水道，水蛭素是凝血酶特异性抑制剂，具有扩张毛细血管、缓解小动脉痉挛和降低血液黏着力的作用［3］，还可抑制胆固醇与脂肪酸合成有关酶的表达及活性，调节脂质代谢，对血栓形成起预防作用［4-5］。通心络胶囊中人参-水蛭被用作预防心血管疾病不良预后的主要药物。

网络药理学是基于生物学和药理学等多种理论体系，从多视角阐明药物、成分、靶点和疾病之间的协同效应和潜在机制。其整体性、系统性完美契合了中药多成分、多靶点、多渠道治疗疾病的方式和中医药整体观及辨证论治特色［6］。本研究基于网络药理学系统分析参蛭通心胶囊核心药对人参-水蛭治疗DCM的作用机制，以期为指导临床和今后的深入研究提供思路和理论依据。

1 研究方法

1.1 人参-水蛭药对成分与靶点获取通过中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP；https：//tcmspw.com/tcmsp.php）以“人参”为关键词检索并选取口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18的活性成分，进而预测其作用靶点；通过BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）数据库以“水蛭”为关键词，将分数截止值设置为20，调整后P值设置为0.05，检索其活性成分，预测水蛭作用靶点。将人参-水蛭药对潜在靶点导入UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库，对基因进一步标准化处理，最终获得人参-水蛭药对的基因靶点。

1.2 DCM靶点获取检索人类基因数据库（the human gene database，GeneCards；https：//www.genecards.org/），检索关键词“Dilated cardiomyopathy”，获得DCM的已知靶点。

1.3 人参-水蛭药对治疗DCM靶点获取运用Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）平台将人参-水蛭药对的基因靶点与DCM的已知靶点取交集，得到人参-水蛭药对治疗DCM的潜在作用靶点。

1.4 人参-水蛭药对成分及其与DCM对应靶点网络构建将人参-水蛭药对的成分及药对与DCM的交集靶点导入Cytoscape3.7.2软件，构建其“药物-疾病-成分-靶点”网络，节点代表人参-水蛭、人参-水蛭药对成分、DCM、药物与疾病的交集靶点，边代表人参-水蛭与其成分、人参-水蛭成分与交集靶点、DCM与交集靶点之间的相互作用。

1.5 蛋白-蛋白互作网络（protein-protein interactions，PPl）与核心靶点图的制作将药物-疾病交集靶点导入STRING（https：//stringdb.org）数据库，选取物种为“人”（Homo sapiens），规定minimum required interaction score＞0.4，构建药物-疾病PPI网络。将STRING分析出的数据导入Cytoscape 3.7.2软件，选取Degree值大于平均值及以上的靶点构建核心靶点网络。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）、京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析将药物-疾病交集靶点导入基因功能注释数据库（the database for annotation visualization and integrated discovery，DAVID；https：//david.ncifcrf.gov），选择“OFFICE_GENE_SYMBOL”选项，将物种限定为“人”（Homo sapiens）。以P≤0.05为条件筛选得到人参-水蛭药对治疗DCM的生物过程及相关通路。利用OmicShare（https：//www.omicshare.com/）云平台，导入筛选得到的数据，通过分析人参-水蛭药对作用于DCM的生物过程和通路传导过程，得到GO气泡图和KEGG条形图。

2 结果

2.1 人参-水蛭药对有效成分筛选结果共得到人参活性成分190个，符合筛选条件的有效成分共22个；水蛭有效成分13个。最终得到人参-水蛭药对潜在有效成分共35个，主要有豆甾醇、β-谷甾醇、山柰酚、人参皂苷Rh2、栀子苷、京尼平苷、D-甘露醇、西红花酸、熊果酸等。见表1—2。

表1 水蛭活性成分

表2 人参活性成分

2.2 药物-疾病交集靶点在人参-水蛭药对35个潜在有效成分中，通过UniProt数据库找到人类相关基因靶点391个，通过GeneCards数据库找到DCM靶点3378个，最终得到人参-水蛭药对与DCM的共同靶点184个。见图1。

图1 药物-疾病交集靶点Venn图

2.3 人参-水蛭药对成分及其与DCM对应靶点网络人参-水蛭与DCM的“药物-成分-疾病-靶点”网络中共有222个节点（其中DCM1个，人参、水蛭各1个，共同靶点184个，活性成分35个）。图中红色代表人参成分，绿色代表水蛭成分，黄色代表药物-疾病共同靶点，蓝色代表人参-水蛭和DCM。见图2。

图2 药物-成分-疾病-靶点网络

2.4 PPl网络与核心靶点网络药物-疾病PPI网络中共有184个节点，1656条边，Degree平均值为18，图中节点代表蛋白质，边代表蛋白质与蛋白质的联系。以平均Deree值为18，Degree值大于25为条件筛选核心靶点，制作核心靶点网络，圆形从大到小代表Deree值由高到低，Degree值越高表明越有可能是人参-水蛭药对治疗DCM的关键核心成分。这些核心靶点主要有胰岛素、白蛋白、肿瘤坏死因子、内皮一氧化氮合成酶、白细胞介素1β等。见图3—4。

图4 药物-疾病核心靶点网络

2.5 GO功能与KEGG通路富集分析GO分析主要包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细胞组成（cellular component，CC）分析，设置BP、CC、MF及KEGG的P值、FDR均小于0.05，得到204条BP，40条CC、42条MF和79条KEGG通路。各选取BP、CC、MF前20条结果，利用OmicShare绘制气泡图，见图5—7。气泡面积越大代表目标基因集中于term的基因越多，气泡颜色越深表示富集程度越高。KEGG分析前20条通路名称、基因数量，应用-log（p）分析制作成条形图，见图8。

图5 BP分析气泡图

图6 CC分析气泡图

图7 MF分析气泡图

图8 KEGG富集通路分析结果

BP主要有药物反应、一氧化氮生物合成过程的正调控、细胞间信号传递、对凋亡过程的负调控等。CC主要在细胞膜、细胞外间隙、电压门控钙通道复合体等。MF主要与药物结合、类固醇激素受体活性、蛋白结合等有关。信号通路主要包括cAMP信号通路、钙信号通路、逆行内源性大麻素信号转导通路、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）能突触通路等。

3 讨论

DCM属中医“心胀”范畴，涉及的脏腑以心为主，旁及脾、肺、肾、肝等。DCM以心气虚为本，瘀血、水湿、邪毒为标，心气虚无力行血而致瘀，虚实相互搏结演变为气虚血瘀病机，后因病程迁延，心气虚加重，从而大气下陷，气血失调［7］，治以补气活血，养血通脉。

本研究共收集到人参-水蛭药对35个有效成分，其中豆甾醇具有抗氧化、抗炎症、降低胆固醇、镇痛、抗糖尿病、保护精神状况、抗肿瘤等作用［8］。β-谷甾醇可通过调节局部免疫功能、抑制前列腺素合成、增强巨噬细胞活性、减少炎性因子［如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）］的分泌等来发挥抗炎作用［9-11］，同时抑制血管内皮细胞黏附分子及其在细胞内的表达，抑制动脉硬化，保护心脏［12］；山柰酚可抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒等，一定程度上可对抗脑缺血再灌注引起的神经炎症损伤［13］；人参皂苷Rh2可调节肿瘤免疫，产生免疫因子，提高机体免疫应答；又可抑制免疫亢进［14］，促进中脑动脉闭塞大鼠血管新生，激活Keap1/Nrf2信号通路、提高抗氧化酶的活性从而抑制氧化应激反应［15］；栀子苷是一种抗炎物质，可通过NF-κB/PI3K/Akt等信号通路抑制IL-1β，从而抑制小鼠脊髓细胞炎症反应［16-17］；熊果酸、西红花苷［18-19］及京尼平苷均具有抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡等多种生物学活性［20-22］，而炎性反应、氧化应激和继发性细胞凋亡都是心血管疾病病理变化过程中的重要一环［23-25］，熊果酸预处理能降低急性心肌梗死大鼠左心室舒张内径和收缩内径，升高射血分数和每搏输出量，降低左心室心肌梗死面积，修复心肌纤维断裂，间质水肿，炎性浸润等，对大鼠心功能和左心室心肌病理学改变及细胞超微结构病变具有保护作用［26］；西红花酸在病理切片中可表现出对心肌水肿、坏死等的保护作用［27］；西红花酸含药血清可有效降低受试对象血液中乳酸脱氢酶、肌酸激酶、丙二醛，提高超氧化物歧化酶含量，增强细胞活力［28］；甘露醇小剂量使用能提高人体血浆渗透压，加速组织脱水，进而降低炎性因子水平，可对包括肺脏在内的多种组织器官的急性炎症反应具有积极改善作用［29-30］。可见，人参-水蛭各成分多通过抗炎、抗氧化、抑制细胞凋亡、抗水肿及免疫调节等作用于DCM的各种病理过程。

通过核心靶点网络图可推测人参-水蛭配伍治疗DCM可能与胰岛素、白蛋白、TNF、一氧化氮合酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）、过氧化物酶体增生激活受体γ、IL-1β等靶点相关。白蛋白为血清中高特异性、高敏感性抗氧化物质，低血清白蛋白可能是心肌梗死潜在预测指标，且心肌缺血标志物缺血修饰白蛋白也由ALB在特定条件下产生［31-32］。超敏C反应蛋白/白蛋白水平高低与心室损伤、重构程度及心功能强弱成负相关。NOS3属NOS家族，主要通过剪切力、血管内皮和乙酰胆碱作用，释放一氧化氮舒张血管，提高血管通畅度，活化内皮细胞并调控平滑肌细胞增殖，与多种疾病的进程相关［33］。IL-1β升高可直接抑制心肌组织或诱导炎症反应，间接损害心肌，引起心肌肥大，加速心肌纤维化，促使心肌细胞衰亡，降低心脏供血能力，参与心衰进程［34］。心肌梗死后心室重构及心衰患者给予IL-1β拮抗剂后外周血炎症因子下调，心功能改善，提示其可能成为临床治疗DCM的重要潜在靶点。TNF是机体内一种重要细胞凋亡调节因子，TNF水平越高，慢性心衰越严重，心肌、乳头肌肌力越差。其过度升高会导致心肌细胞外间质胶原沉积及心肌组织纤维化，左室收缩减弱、心脏重构和扩张，从而加重心肌损伤和心功能恶化［35］。细胞实验表明TNF-α对心脏衰竭及恶性病变等的发生、发展具有重要影响［36］。

GO和KEGG分析显示多个BP、CC、MF和通路参与人参-水蛭药对治疗扩张型心肌病的过程。其中，环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）作为传递生命活性信息和参与物质代谢的重要组分，可正向引导心肌细胞收缩程度和存活情况，改善心功能，增加心输出量，扩张外周血管，降低心脏前、后负荷，发挥滋养心肌、正性肌力、舒张血管、抗血液凝集和调控心率等多重作用［37-38］。张莉等［39］证实与心律失常密切相关的K+离子通道受蛋白激酶A通路调控，而蛋白激酶A是cAMP传导通路中的一个重要组成。Ca2+信号通路在细胞存活、增殖、代谢中至关重要，与冠心病、心肌纤维化、心肌肥大在内的多种心脏病的发生关系密切［40］。对DCM患者而言，抗ADP/ATP的血清抗体可使细胞膜钙电流及胞浆游离钙浓度增高，进而引起心肌细胞损伤，钙离子拮抗剂则可防止该现象［41］。逆行内源性大麻素信号转导通路可通过拮抗CBl受体（也分布于心脏）等发挥抗炎和神经保护等作用［42］。5-HT可诱发冠状动脉痉挛［43］，所以可通过抑制5-HT能突触通路缓解血管痉挛。对于DCM的治疗而言，人参-水蛭的主要靶点在细胞膜、细胞外间隙、电压门控钙通道复合体等，通过cAMP信号通路、心肌收缩信号传导通路、钙信号通路、多巴胺能突触通路、逆行内源性大麻素信号转导通路、5-HT能突触通路等通路起到一氧化氮生物合成正调控、细胞间信号传递、对凋亡过程的负调控等作用。

综上所述，参蛭通心胶囊的核心药对人参-水蛭通过多成分、多靶点、多通路有效阻断DCM的病因，对心脏扩大、心律失常、血栓栓塞等起有效预防和治疗作用，降低猝死风险。但本研究存在一定缺陷，数据库未考虑到药物剂型问题，药物进入体内方式是否会引起疗效差异，而且不能预测对尚未发现的DCM发病机制是否有效等局限性。