基于GC-MS和UPLC法刺梨和无籽刺梨指纹图谱研究

张得香，刘孟华，潘丹阳，林琳，徐崇，何敬愉,3*

1.广州环亚化妆品科技股份有限公司 （广州 510700）；2.南方医科大学药学院 （广州 510515）；3.华南师范大学化学学院 （广州510006）

刺梨（Rosaroxburghiitratt）和无籽刺梨（Rosasterilis）同属蔷薇科植物，是云贵高原及攀西高原特有的野生资源，其果实中含有丰富的营养物质，如维生素、人体必需氨基酸、蛋白质等。同时，刺梨和无籽刺梨中含有的黄酮类化合物、有机酸、多糖、超氧化物歧化酶（SOD），具有抗菌、抗衰老[1]、抗凋亡[2]、抗氧化[3]、抗动脉粥样硬化等生物活性[4-7]。此外，刺梨和无籽刺梨中维生素C（VC）、维生素P（VP）及SOD含量在所有果蔬中均最高，享有“三王水果”之美誉，所以也常被加工成果酒、果醋、果汁饮料、果茶、果酱及滋补口服液等食品[8-9]。

近年来，由于刺梨和无籽刺梨密切的亲缘关系，果实性状相似，两者在功能食品加工中出现混用现象。指纹图谱技术是一种综合、可量化的鉴定手段，能稳定、可靠地区分不同品种间的差异，被应用于食品的品种判别中[10]。对刺梨和无籽刺梨的研究报道主要集中在挥发油、氨基酸、微量元素、三萜皂苷和维生素C等营养物质[11-13]。但鲜有文献系统比较刺梨和无籽刺梨营养成分差异。因此，选取刺梨和无籽刺梨各5批，采用GC-MS和UPLC法，构建刺梨和无籽刺梨挥发性成分和水溶性成分指纹图谱，联合使用聚类分析，探讨刺梨和无籽刺梨挥发性成分和水溶性成分异同，为刺梨膳食补充、药物制剂和疾病治疗中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

新鲜刺梨S1～S5（安顺、毕节、贵阳、黔东南、遵义）5批和无籽刺梨S6～S10（安顺、贵阳、黔东南）5批各采于贵州省不同地区；其样品信息如表1所示。

表1 10批刺梨和无籽刺梨样品来源

咖啡酸、没食子酸、槲皮素、槲皮苷、芦丁和木犀草素标准品（阿拉丁）；甲醇、甲酸、正己烷（美国Merck公司）。

1.2 主要仪器设备

7890A/5975C气质联用仪（美国Agilent公司）；HP-5MS毛细管柱（美国Agilent公司）；BT25S电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；UPLC H08UPB902M液质联用仪（美国Waters公司）；H1750R高速冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；高纯水仪（美国Millipore）。

1.3 试验方法

1.3.1 刺梨和无籽刺梨挥发性成分的制备

采用水蒸气馏法。取100 g鲜果，用高纯水冲洗3遍后于破碎机打碎，置于500 mL锥形瓶中，加入200 mL高纯水，于挥发油提取装置中加热3 h，待冷却至室温后，取油状层用正己烷萃取，无水硫酸钠干燥后用0.45 μm滤膜过滤于气相色谱进样瓶中待测。

1.3.2 刺梨和无籽刺梨水溶性成分的提取

为保证活性物质的稳定，每批次样品各取500 g于硅胶中常温干燥后用粉碎机粉碎并保存在干燥器中。准确称取干粉1 g于50 mL锥形瓶中，加入25 mL甲醇后超声提取30 min，用滤纸过滤，取滤渣，加入25 mL甲醇超声30 min后过滤，合并2次滤液并旋转蒸发浓缩，用甲醇定容至10 mL容量瓶，得到刺梨和无籽刺梨提取液，用封口膜密封后置于4 ℃保存。离心（14 000 r/min）10 min，0.22 μm微孔滤膜过滤于棕色容量瓶中待测。

1.3.3 对照品溶液的制备

称取咖啡酸、没食子酸、槲皮素、槲皮苷、芦丁和木犀草素6种化学对照品适量，精密称定，分别置于棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL含上述样品1 mg的对照品溶液。分别取对照品溶液各一定量置1 mL棕色量瓶中，作为对照品稀释液；分别取对照品稀释液一定量，置于同一1 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得终质量浓度分别为0.02，0.02，0.02，0.02，0.02和0.02 mg/mL的混合对照品溶液。

1.3.4 GC-MS分析条件

气相色谱条件：色谱柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱；色谱升温条件：初始温度50 ℃，初始温度保持1 min后，以15 ℃/min的速率升温至160 ℃，以5 ℃/min的速率升温至280 ℃并保持5 min，载气为高纯He（纯度99.999 5%），载气流量2 mL/min，进样量5 μL，不分流进样。

质谱检测条件：离子源为EI源，进样口温度280 ℃；离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描质量范围50～500 AMU，溶剂延迟时间3 min。

1.3.5 UPLC分析条件

UPLC色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC RBEH 18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；采用0.1%甲酸水溶液-甲醇为流动相梯度洗脱；梯度条件见表2。进样体积10 μL；柱温30 ℃；流速0.3 mL/min，检测波长254 nm。UPLC检测色谱梯度条件见表2。

表2 UPLC检测色谱梯度条件

1.3.6 指纹图谱构建

根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，将5批刺梨和5批无籽刺梨数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012版，制定指纹图谱，采用阿拉伯数字标出共有峰，用“S”标出参照物峰。以对照品指纹峰或峰面积较大、较稳定的共有峰作为参照峰，定义参照峰的峰面积作为1，计算其他各共有峰面积与参照物峰面积的比值，计算10批供试品的平均比值。非共有峰总面积不得大于总面积的10%。

1.3.7 相似度分析

以刺梨和无籽刺梨GC-MS指纹图谱或HPLC指纹图谱共有模式作为10批样品指纹图谱色谱峰匹配的依据，采用夹角余弦法计算各样品指纹图谱的相似度。

1.3.8 聚类分析

对5批刺梨和5批无籽刺梨GC-MS指纹图谱分析，获得共有峰，将各色谱峰相对内参比峰的峰面积量化，得到原始数据矩阵，运用SPSS 19.0软件进行系统聚类分析，采用组间联结法，利用欧式距离作为样品的测度。

1.3.9 方法学考察

1.3.9.1 重复性试验

取6份供试品遵义刺梨（S4），按照1.3.2的方法制备供试品溶液，按照1.3.5的色谱条件进样，记录其中6个共有色谱峰的保留时间和峰面积，以对照谱图峰型较好的峰为参照峰（S），图谱中各个峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算它们之间的SRSD。

1.3.9.2 稳定性试验

取1份供试品无籽刺梨黔东南2（S10），按照1.3.2的方法制备供试品溶液，按照1.3.5的色谱条件进样，在0，4，8，16和24 h记录色谱图，记录其中6个共有色谱峰的保留时间和峰面积，以对照谱图峰型较好的峰为参照峰（S），图谱中各个峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算它们之间的SRSD。

1.3.10 数据处理

气质数据采用MSD ChemStation E.02.02.1431软件（Agilent）进行处理。未知化合物质谱图经计算机检索同时与NIST 05 library质谱库相匹配，并结合人工图谱解析及资料分析，仅报道匹配度均大于85（最大值100）的鉴定结果。

液相数据采用MssLynx V4.1（Waters）工作站进行记录和处理。

2 结果与分析

2.1 GC-MS结果

2.1.1 GC-MS指纹图谱建立

将5批刺梨和5批无籽刺梨样品GC-MS数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004版本）”软件进行处理，分别生成刺梨和无籽刺梨指纹图谱。5批刺梨样品中S3样品和无籽刺梨S6样品色谱图中色谱峰峰型、分离度良好，基线平整，故择其为参照指纹图谱。选择中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，时间窗宽度设为0.1，对色谱峰进行全谱峰匹配。结果如图1所示。

图1 刺梨和无籽刺梨色谱峰匹配图

图2 聚类分析结果

2.1.2 相似度评价

利用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版本）”软件对5批不同产地的刺梨和5批不同产地的无籽刺梨挥发性成分进行相似度评价，结果见表3和表4。

表3 刺梨相似度评价

表4 无籽刺梨相似度评价

5批刺梨样品相似度范围在0.757～0.917之间，说明不同产地刺梨挥发性成分存在一定差异，贵阳和黔东南地区产样品S3和S4与对照指纹图谱相比相似度均大于0.9，安顺和遵义地区产样品S1和S5与对照指纹图谱相比相似度均小于0.8，说明贵阳和黔东南地区产的刺梨挥发性成分和质量较接近，安顺和遵义地区产的无籽刺梨挥发性成分和质量存在一定差异。

5批无籽刺梨样品相似度范围在0.358～0.816之间，说明不同产地和同一产地不同批次无籽刺梨挥发性成分存在一定差异，同为安顺地区产的无籽刺梨S6和S7样品与对照指纹图谱相比相似度相差2.3倍，同样的，同为黔东南地区产的无籽刺梨S9和S10样品与对照指纹图谱相比相似度相差1.6倍，S6、S8、S9、S10样品与对照指纹图谱相比相似度均小于0.8，说明不同地区产的无籽刺梨挥发性成分和质量存在很大差异，而同一地区产的无籽刺梨不同批次挥发性成分和质量同样存在很大差异。

2.1.3 聚类分析

将5批刺梨与5批无籽刺梨指纹图谱中67个色谱峰的相对峰面积数据（表5）导入SPSS软件中，采用欧式距离对5批刺梨与5批无籽刺梨进行聚类分析，结果见图3。

图3 刺梨和无籽刺梨色谱峰匹配图

表5 刺梨和无籽刺梨67个色谱峰的相对峰面积值

聚类结果分为3类时，第1类为S6，第2类为S5和S8，第3类为S3、S4、S2、S1、S7、S10和S9。第3类中的刺梨药材主要集中于贵州省的西北部，结合指纹图谱与相似度评价，可见这几批刺梨药材的挥发性成分较相似。研究表明，影响植物挥发性成分的因素包括树种、光照、温度和臭氧等[14-15]，结合指纹图谱与相似度评价，产自安顺的无籽刺梨S6与其他样品差异较大，且S6与同一产地不同批次的S7不成一类，其原因可能为因地理位置和品种的不同，使得产生挥发性成分相关酶（β-氧化酶）的活性或者专一性不同，造成挥发性成分的转化速率和比例不同，导致2种刺梨果实挥发性成分浓度有差异[16]。

2.2 UPLC结果

2.2.1 UPLC指纹图谱建立

将5批刺梨和5批无籽刺梨样品UPLC数据导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004版本）”软件进行处理，分别生成刺梨和无籽刺梨指纹图谱。5批刺梨样品中刺梨S3样品和无籽刺梨S7样品色谱图中色谱峰峰型、分离度良好，基线平整，故择其为参照指纹图谱。选择中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，时间窗宽度设为0.1，对色谱峰进行全谱峰匹配。

如图3所示，从5批刺梨和5批无籽刺梨样品的指纹图谱中通过与对照品色谱图中的保留时间比较，初步可指认5个共有峰，其中3号峰的分离度较好，且位置较居中，则以其为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间。

植物黄酮类成分是一种被广泛认可的天然抗氧化剂，同时具备抗抑菌、降血脂和抗肿瘤等作用，其中芦丁是有效成分之一，具有很好的抑菌、抗炎等作用[17]。有研究表明，从刺梨中提取的芦丁对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌等有明显的抑菌效果[18]。由图3可知，不同产地刺梨和无籽刺梨中黄酮类含量具有较大差异，其中刺梨中芦丁的含量较无籽刺梨高。由于无籽刺梨中关于黄酮类的研究较少，所以刺梨和无籽刺梨中黄酮类含量差异需要进一步研究确定。

2.2.2 相似度评价

利用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版本）”软件对5批不同产地的刺梨和5批不同产地的无籽刺梨水溶性成分进行相似度评价，结果见表6和表7。

表6 刺梨相似度评价

表7 无籽刺梨相似度评价

由表6可知，5批刺梨样品指纹图谱与对照图谱相似度范围在0.885～0.977之间，其中样品S1、S2、S4、S5与对照指纹图谱的相似度均大于0.9，存在的差异比较小，说明刺梨S1、S2、S4、S5中水溶性成分比较接近，受地理环境的影响较小；而产自贵阳的刺梨样品S3与其他产地样品相比水溶性物质相似度较小。

由表7可知，5批无籽刺梨样品相似度范围在0.790～0.904之间，其中产自安顺地区的无籽刺梨S6和S7相似度大于0.9，可认为两者差异较小；而S8、S9和S10指纹图谱与对照图谱相比，相似度均在0.9以下，其中S9和S10差异较大，其可能原因是采收时间不同，导致两者水溶性成分存在一定差异。相比于不同产地的刺梨，不同产地的无籽刺梨水溶性成分差异较大。

2.2.3 聚类分析

将5批刺梨与5批无籽刺梨指纹图谱中12个共有色谱峰的峰面积数据（表8）导入SPSS软件中，采用欧式距离对5批刺梨与5批无籽刺梨进行聚类分析，结果见图4。

图4 聚类分析结果

表8 刺梨和无籽刺梨共有色谱峰的峰面积值

由图4结果可知，经过聚类分析，聚类结果可分为A、B、C两大类，分别为A，S3；B，S1、S2、S4、S5；C，S6、S7、S8、S9、S10。由分析可知，不同产地的无籽刺梨可归为一类。植物水溶性成分含量可能与土壤中微量元素（如锰、钾或氮）、水分含量或者pH的大小有关[19-20]。图4结果中产地为贵阳的样品S3独自成一类，结合指纹图谱与相似度评价，可能原因为由于土壤微量元素、水分或pH影响导致该产地的刺梨与其他产地的刺梨水溶性成分具有一定差异性[21]。但是具体影响因素还需进一步研究。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 重复性试验

称取供试品遵义刺梨1份，按照1.3.2的方法制备供试品溶液，1.3.5的色谱条件进样，记录色谱图。主要5个色谱峰的保留时间和相对峰面积的SRSD结果如表9，相对保留时间SRSD均小于1.0%，相对峰面积SRSD均小于1.0%，表明该方法重复性较好。

表9 相对保留时间和相对峰面积的SRSD 单位：%

2.2.4.2 稳定性试验

称取1份供试品无籽刺梨（黔东南），按照1.3.2的方法制备供试品溶液，按照1.3.5的色谱条件进样，在0，4，8，16和24 h记录色谱图。记录色谱图。主要5个色谱峰的保留时间和相对峰面积的SRSD结果如表10所示。结果表明，测得主要色谱峰的相对保留时间和相对峰面积SRSD均小于1.0%。即此供试品溶液在24 h内较稳定。

表10 相对保留时间和相对峰面积的SRSD 单位：%

3 结论

试验主要以来自不同产地的刺梨和无籽刺梨各5批为原料，通过GC-MS和UPLC法记录色谱图，结合相似度评价、聚类分析方法对其成分差异进行比较。结果表明，相比于刺梨，无籽刺梨挥发性成分相似度普遍偏小，说明无籽刺梨间挥发性成分的差异较大，来自地理位置较集中的区域的刺梨和无籽刺梨在挥发性成分上比较接近；而两者的水溶性成分（主要分析对象为黄酮类成分）则有一定差异。试验成果对刺梨和无籽刺梨在食品或者医药行业的开发利用提供参考。