一株兔源大肠埃希氏菌噬菌体的分离及生物学特性分析

屈平平,王一鸣,解红梅,温华梅,李 涛

(山东畜牧兽医职业学院,山东潍坊 261061)

噬菌体(Phage)作为细菌的天然“杀手”,对细菌具有特异性裂解作用,且不易出现耐药性,在自然界广泛存在,容易获取和大规模生产,在疾病防控、环境消毒、水产养殖、食品保存等方面具有很高的利用价值[1-4]。本研究以前期分离鉴定的兔致病性大肠埃希氏菌为宿主菌,采用点滴法和双层琼脂平板法,从山东规模化肉兔养殖场污水中筛选出效价高、裂解谱广、抗逆性强的噬菌体,旨在将其开发为一种抗生素替代品和新型环境消毒剂,用于肉兔大肠杆菌病的防控,对于推进肉兔养殖意义重大。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 污水 从山东地区(青岛、潍坊、临沂、莱芜)肉兔养殖较为密集的养殖场周边收集污水。

1.1.2 细菌 用于筛选噬菌体的11株兔肠源致病性大肠埃希氏菌(tE1-tE11),用于测定噬菌体裂解谱的22株兔肠源致病性大肠埃希氏菌(tE1-tE11,ATE1-ATE11),2株鸡源致病性大肠埃希氏菌(SJE1-SJE2),产肠毒素性大肠埃希氏菌标准株K88和K99,均为潍坊市特种经济动物健康养殖关键技术重点实验室分离鉴定与保存。

1.1.3 主要试剂 麦康凯培养基、营养琼脂液体培养基、营养琼脂固体培养基,北京路桥技术有限公司产品;浓盐酸、NaOH,烟台远东精细化工有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 气浴恒温振荡器(THZ-100),电热恒温水浴锅(HWS-28),均为上海一恒科学仪器有限公司产品;透射电子显微镜(HT7700型),为日立(中国)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体原液制备 将污水12 000 r/min离心10 min去除大部分固体杂质,上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。将0.1 mL污水过滤液加入10 mL LB液体培养基中,再加入0.1 mL宿主菌,在气浴恒温振荡器37℃、180 r/min振荡培养过夜,次日将培养液8 000 r/min离心15 min,取上清,经0.22 μm微孔滤膜过滤,得到噬菌体原液,4℃冰箱保存备用。

1.2.2 噬菌体的初选 取100 μL宿主菌菌悬液均匀涂布于 LB固体培养基平板上,在平板背面画出分割线并进行标号,根据平板标号点滴噬菌体原液,每个标号方格中滴加10 μL,37℃恒温培养箱过夜培养,观察有无空斑出现。将空斑大而透亮的样品4℃冰箱保存备用。

1.2.3 噬菌体的分离与纯化 将空斑用无菌眼科手术镊扣出,加入10 mL LB液体培养基,再加入100 μL大肠埃希氏菌菌悬液,37℃、180 r/min振荡培养过夜,次日将噬菌体原液过0.22 μm微孔滤膜过滤,得到噬菌体过滤液,然后进行梯度稀释,取0.1 mL合适梯度噬菌体稀释液与0.2 mL宿主菌种子液混合,加入4 mL 约50℃ LB半固体培养基,混匀后倒入LB平板上,平板凝固后倒置于37℃培养箱4～6 h观察有无噬菌斑。将出现噬菌斑样品4℃冰箱保存备用,并利用双层平板法重复3～5次,得到纯化的噬菌体。

1.2.4 噬菌体电镜观察 取15 μL噬菌体过滤液滴于铜网上,静置15 min,用滤纸吸干多余液体,然后加2%磷钨酸染色10 min,干燥后通过透射电子显微镜观察其形态。根据《根据国际病毒分类委员会(ICTV)在2011年发布的第9次报告中噬菌体的分类与命名标准》[5]和相关文献对噬菌体进行分类和命名[6]。

1.2.5 大肠埃希氏菌噬菌体最佳感染复数测定 将宿主菌的浓度调整为1.0×107CFU/mL。MOI分别设定0.001、0.01、0.1、1、10、100,分别取500 μL噬菌体液和500 μL宿主菌菌液加入9 mL LB液体培养基,在气浴恒温振荡器37℃、180 r/min 振荡培养6～8 h。将混合培养物12 000 r/min离心5 min,取上清液,经0.22 μm微孔滤膜过滤,保留过滤液,测定噬菌体效价。每个MOI值,做3个重复,产生最高效价的感染复数即为噬菌体的最佳MOI。

1.2.6 大肠埃希氏菌噬菌体一步生长曲线测定 将宿主菌浓度调整为在107CFU/mL左右,将噬菌体液与宿主菌液以最佳感染复数的比例在37℃水浴锅中孵育5 min后;12 000 r/min 离心1 min,去上清,LB液体培养基洗涤3次,将洗涤后的溶液加入100 mL LB液体培养基,充分混匀后于气浴恒温振荡器37℃振荡培养;从0 min开始取样,每隔20 min 取样1次,至160 min,测定噬菌体的效价,每个试验设3个重复。

1.2.7 大肠埃希氏菌噬菌体温度稳定性测定 将盛有500 μL噬菌体的离心管分别放置于温度为40、50、60、70℃的电热恒温水浴锅中,分别在30 min和60 min后取样,用双层平板法分别测定噬菌体效价变化,每个试验设3个重复。

1.2.8 大肠埃希氏菌噬菌体pH稳定性测定 用浓盐酸和NaOH溶液调整LB液体培养基的pH分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11,每个pH均取200 μL,加入200 μL 109pfu/mL 的噬菌体液混匀,混匀后于37℃电热恒温水浴锅作用1 h。利用双层平板法测定噬菌体效价,每个试验设3个重复。

1.2.9 大肠埃希氏菌噬菌体裂解谱测定 利用密集画线法将对数生长期的菌液均匀涂布于LB平板上,待干后,取5 μL噬菌体液滴在平板上,37℃恒温培养箱过夜培养,次日观察平板出现空斑的情况。若空斑大而透亮,说明噬菌体可彻底裂解该菌,记为++;若空斑比较模糊,或空白内仍有少量菌落,说明噬菌体不能彻底裂解该菌,记为+;若无空斑,说明噬菌体不能裂解该菌,记为-。

2 结果

2.1 噬菌体分离与纯化结果

用滴定法筛选出1株以兔致病性大肠埃希氏菌tE10为宿主菌的噬菌体,该噬菌体所出现的空斑大而透亮(图1),利用双层平板法对该噬菌体进行分离和纯化,得到的噬菌斑呈圆形,直径2～2.5 mm,边缘整齐无晕环,完全透亮(图2)。

图1 噬菌体所形成的空斑

图2 噬菌体的噬菌斑形态

2.2 噬菌体的电镜观察结果

通过透射电镜观察到该噬菌体,头部呈20面体,长径约52.5 nm,横径约51.6 nm,尾部长约86.9 nm,有明显的颈部(图3)。从形态和结构上可初步判定该株噬菌体均为有尾噬菌体目,长尾噬菌体科,将本噬菌体命名为vB-EcoS-tE10。

图3 噬菌体vB-EcoS-tE10电镜形态

2.3 最佳感染复数及一步生长曲线的测定

当MOI=0.1时,噬菌体vB-EcoS-tE10产生子代数量最多,效价为7.2×109PFU/mL,该噬菌体的最佳MOI=0.1(表1)。该株噬菌体在前20 min效价稳定,40 min后迅速上升,80 min到达峰值后至120 min保持平稳,120 min后效价略有下降,可知该株噬菌体潜伏期为20 min,暴发期为80 min,裂解量为608 PFU/cell(表2)。

表1 最佳感染复数

表2 一步生长曲线

2.4 温度及酸碱稳定性

该噬菌体在30℃和40℃作用30 min和60 min,效价几乎没有变化;在50℃作用30 min和60 min,效价仅下降了一个数量级;但在60℃和70℃作用下,随时间延长,噬菌体效价急剧下降(表3),该噬菌体可在pH4～10之间存活,在pH为6～9范围内可保持很高的效价(表4)。

表3 噬菌体热耐受性

表4 噬菌体pH耐受性

2.5 噬菌体裂解谱的测定

该噬菌体可裂解宿主菌tE10,还可裂解8株兔源大肠埃希氏菌(tE1、tE2、tE5、tE6、ATE5、ATE9、ATE10、ATE11)、1株鸡源大肠埃希氏菌(SJE1)和1株产肠毒素性大肠埃希氏菌标准株K99,裂解率为11/26(42.31%),具有较宽的裂解谱(表5)。

表5 噬菌体对大肠埃希氏菌的裂解能力

3 讨论

本试验筛选的大肠埃希氏菌噬菌体为有尾目、长尾科,与禽源、猪源、牛羊源大肠埃希氏菌噬菌体在形态上相似[7-9],符合大肠埃希氏菌噬菌体的一般特征。有研究从腹泻死兔肝脏中分离出1株致病性大肠埃希氏菌ZR1,并以ZR1为宿主菌,筛选出1株噬菌体ZRP1,该噬菌体的潜伏期为25～20 min,裂解量约144 PFU/cell[10]。也有研究以兔致病性大肠埃希氏菌ZJE1为宿主菌,分离到5株噬菌体ZRP1、ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5,其中噬菌体ZRP2潜伏期为16～19 min,裂解量约为150 PFU/cell,噬菌体ZRP3潜伏期为11～14 min,裂解量约为110 PFU/cell,噬菌体ZRP4潜伏期为16～19 min,裂解量约为170 PFU/cell[11]。本试验筛选的大肠埃希氏菌噬菌体vB-EcoS-tE10潜伏期约为20 min,裂解量为608 PFU/cell,与以上大肠埃希氏菌噬菌体相比,潜伏期差异不大,但裂解量是上述噬菌体的4～5倍。因此该噬菌体的裂解能力较强,开发利用价值更高。

适宜的pH和温度是噬菌体保持活性的关键。大肠埃希氏菌噬菌体vB-EcoM-tE10在30～50℃效价几乎不受影响,在60℃作用30 min和60 min效价有所下降,在pH 4～10范围内可以存活,在pH为6～9均保持很高的效价,对热和酸碱的耐受性更强[12-13],这种性能更有利于噬菌体制剂的长期保存和商业化生产。

大部分噬菌体裂解细菌的特异性较强,在一定程度上限制了噬菌体使用,但是自然界中多价宽谱噬菌体也存在[14]。本试验筛选的大肠埃希氏菌噬菌体对兔源致病性大肠埃希氏菌的裂解能力较强,还能裂解一株禽源致病性大肠埃希氏菌和一株产肠毒素性大肠埃希氏菌K99,可能该株噬菌体具有识别以上细菌的特殊结构或者分泌某种能够裂解以上细菌的活性物质,需要对该噬菌体进行全基因序列分析,与其他多价宽谱大肠埃希氏菌噬菌体进行比对,从基因水平探究噬菌体能裂解多株细菌的机制,为噬菌体开发利用提供新的思路。