非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法的建立

林彦星,翁巧玉,阮周曦,吴 江,黄超华,金 业,陈 鹏,张彩虹,杨俊兴,曹琛福,史卫军,刘建利,花群义*

(1.深圳海关动植物检验检疫技术中心,广东深圳 518045;2.湖南普简生物科技有限公司,湖南长沙 410013;3.深圳市心月生物科技有限公司,广东深圳 518000)

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病[1]。不同日龄的家猪、野猪都能感染。ASF被世界动物卫生组织(WOAH)列为必须通报的动物传染病[2]。我国《一、二、三类动物疫病病种名录》、《进境动物检疫疫病名录》都归为一类动物疫病[3-4]。2018年8月,我国辽宁省沈阳市发现国内首例非洲猪瘟,病毒基因序列分析与俄罗斯和东欧流行的格鲁吉亚毒株(Georgia 2007)属于同一进化分支,为基因Ⅱ型[5-6]。ASFV粒子呈20面体,有囊膜,基因组为单分子线性双链DNA,基因组长度约为170 kb～194 kb(不同毒株间有差异),包含151～167个开放阅读框,编码多种结构和非结构蛋白[8]。由于ASFV结构较复杂,基因组编码的100多种蛋白中有一半蛋白功能未知,且感染后宿主免疫调节机制尚不明确,使非洲猪瘟疫苗研制困难重重。由于ASFV感染第1周就能产生抗体,且持续时间长,尤其是对亚急性和慢性病例[2,7]。抗体检测对非洲猪瘟疫情监测和防控具有重要意义。ASFV B646L基因编码的p72蛋白是病毒的主要结构蛋白。p72蛋白主要在病毒感染晚期表达,位于病毒衣壳的表面,是该病毒的保守蛋白,具有良好的免疫原性,稳定性强,可作为ASFV血清学检测的主要诊断抗原[8-12]。本研究通过基因工程技术表达p72重组蛋白作为包被抗原,以HRP标记的p72特异性单克隆抗体作为酶标单抗,建立了非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法,可用于大量样品抗体的快速检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、单克隆抗体及血清 ASFV-P72原核表达菌株(pGEX-ASFV-P72)和p72特异性单克隆细胞株(5C11株)由深圳海关动植检中心制备和保存。非洲猪瘟病毒阳性血清,中国兽药监察所产品;猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性血清、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清、猪瘟病毒(CSFV)阳性血清、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清和大肠埃希氏菌BL21(DE3)阳性猪血清由深圳海关动植检中心保存。

1.1.2 实验动物 6～8周龄SPF级Balb/c雌鼠,购自广东省实验动物中心。

1.1.3 主要试剂 辣根过氧化物酶(HRP)、牛血清白蛋白(BSA),sigma公司产品;LB液体培养基、TMB显色液,生工生物工程(上海)有限公司产品;protein Marker(10～180 ku),北京全式金生物技术股份有限公司产品;蛋白浓度测定试剂盒(pierce BCA protein assay kit)、PierceTM无蛋白封闭液(protein-free blocking buffer),Thermo公司产品;蛋白纯化试剂盒(Ni-NTA fast start kit),QIAGEN公司产品;非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测试剂盒,ID.Vet公司产品。

1.1.4 主要仪器 超声波匀质器(UP400S),德国Heilscher公司产品;台式高速离心机(Centrifuge 5415 R),德国Eppendorf公司;Power Pac HC电泳仪、电泳槽、转印槽,美国Bio-rad公司产品。洗板机(ELx50),美国Bio-Tek公司产品;酶标仪(W-100),微思行(北京)科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 ASFV P72重组抗原表达与纯化 将pGEX-ASFV-P72表达菌株划线接种LB培养基平板,挑取单菌落接种于含氨苄青霉素(Amp+)的液体LB培养基中,37℃振摇培养过夜,菌液PCR鉴定后,按照1∶100的比例接入新配制的Amp+LB培养基,待细菌生长到对数期时(约3 h),加入终浓度为1 mmol/L IPTG,37℃诱导表达5 h,离心收集菌体沉淀,加入细菌裂解液重悬沉淀,于冰浴条件下进行超声破碎,12 000 r/min离心30 min,取上清液SDS-PAGE分析,用Ni-NTA Fast Start Kit进行纯化,Western blot法分析纯化重组蛋白的抗原性。

1.2.2 单克隆抗体的纯化和HRP标记 将本实验室保存的杂交瘤细胞株5C11株复苏扩大培养后,腹腔注射经降植烷致敏的6～8周龄健康Balb/c小鼠,接种约1周后收集小鼠腹水,采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体[13],SDS-PAGE电泳测定纯度。采用过碘酸钠法对单克隆抗体进行HRP标记,用间接ELISA方法检测HRP标记单抗5C11-IgG-HRP的效价。

1.2.3 阻断ELISA反应条件的确定 以p72重组蛋白作为包被抗原,采用方阵法确定阻断ELISA反应条件。将p72重组蛋白用碳酸盐缓冲液(0.05 mol/L, pH9.6)按1∶500、1∶1 500、1∶2 500、1∶3 500、1∶4 500进行稀释,包被96孔板后4℃过夜;用洗涤液PBST(含0.5 mL/L Tween-20、0.01 mol/L, pH7.4 的PBS)洗板3次,然后用3% BSA、5%脱脂奶粉和无蛋白封闭液,37℃封闭2 h;洗板3次后,分别加入1∶2、1∶5、1∶10、1∶20稀释的ASFV阳性血清,100 μL/孔,37℃湿盒孵育1 h;洗板3次,加入1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000稀释的酶标单抗5C11-IgG-HRP,37℃作用45 min;洗板5次后加TMB底物液,室温作用10 min左右,加入终止液,酶标仪测定OD450nm值。通过一系列试验确定p72重组蛋白最佳包被浓度和酶标单抗5C11-IgG-HRP最佳工作浓度,以及封闭液的选择,血清稀释比例等。

PI=

1.2.5 特异性试验 用制备的3批非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测试剂盒对CSFV阳性血清、PRV阳性血清、PRRSV阳性血清、PEDV阳性血清、TGEV阳性血清、大肠埃希氏菌BL21(DE3)阳性猪血清、ASFV阳性血清和ASFV阴性血清进行检测。根据阻断率临界值判断该方法的特异性。

1.2.6 敏感性试验 用制备的阻断ELISA抗体检测试剂盒分别对不同稀释度(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560)的ASFV强阳性血清、阳性血清和弱阳性血清进行检测,每份样品做3个平行样,评估所建立方法的敏感性。

1.2.7 重复性试验 对制备的试剂盒进行批内和批间重复试验。检测样品为5份已知的ASFV阳性血清和5份阴性血清,每份样品进行5次重复检测,对测得的OD450 nm值进行统计学分析,验证该方法的稳定性。

1.2.8 符合率试验 应用本试验建立的阻断ELISA方法与商品化非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测试剂盒分别对2019年广东省动物疫病监测计划项目送检的174份血清样品进行检测,计算两者的符合率。

2 结果

2.1 p72重组蛋白制备与纯化

pGEX-ASFV-p72表达菌株经IPTG诱导表达,4 000 r/min 4℃离心20 min收集菌体,加入细菌裂解液重悬并超声破碎,离心后上清液进行SDS-PAGE分析(图1),p72重组蛋白在约71 ku位置上出现特异性条带,而空质粒诱导表达菌在上述位置未出现条带,结果与预期一致。表达产物经Ni-NTA Fast Start Kit试剂盒纯化,Western blot分析,结果显示该重组蛋白能与ASFV阳性血清发生特异性反应(图2)。

M.蛋白分子质量标准;1.空载体蛋白;2.纯化的重组蛋白

2.2 单克隆抗体腹水的制备、纯化

用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,进行蛋白浓度测定,结果蛋白浓度约为9.8 mg/mL。经SDS-PAGE电泳,纯化单抗出现两条特异性条带,其中重链约55 ku,轻链约25 ku,纯度为95%(图3)。

M.蛋白分子质量标准;1.腹水;2.纯化的单抗

2.3 酶标单抗5C11-IgG-HRP效价测定

用过碘酸钠法对单抗5C11-IgG进行HRP标记,用间接ELISA方法检测酶标单抗5C11-IgG-HRP效价。当阳性血清OD450nm值/阴性血清OD450nm值>2.1时,判定为阳性,其所对应的最高稀释倍数作为该酶标单抗的抗体效价,结果酶标单抗的效价为1∶10 000(表1),满足后续试验需要。

表1 酶标单抗效价测定结果

2.4 阻断ELISA最佳反应条件

经方阵法进行阻断ELISA,确定抗原包被浓度为0.625 μg/mL,4℃包被过夜;3% BSA 37℃封闭2 h;加入1∶10稀释的待检血清,100 μL/孔,置37℃孵育1 h,洗板后加入1∶6 000稀释的酶标抗体后置37℃孵育45 min,加入底物液后置室温避光显色10 min,最后加入终止液,测定OD450nm值,计算样品的阻断率。在此条件下,阳性血清阻断率相对较高,阻断效果最好。

2.5 临界值的确定

2.6 特异性试验

用制备的3批阻断ELISA抗体检测试剂盒对CSFV、PRV、PRRSV、PEDV、TGEV、大肠埃希氏菌BL21(DE3)、ASFV等抗体阳性血清和ASFV抗体阴性血清进行检测,除了ASFV抗体阳性血清的阻断率高于50.12%,判为抗体阳性。与其他对照血清和阴性血清无交叉反应,阻断率均小于50%,表明该方法特异性良好(表2)。

表2 特异性检测结果

2.6 敏感性试验

用制备的阻断ELISA抗体检测试剂盒分别对不同稀释度的ASFV强阳性血清、阳性血清和弱阳性血清进行检测,分析检出阳性的最低稀释度。结果表明,ASFV强阳性血清的最低稀释度为1∶640,阳性血清的最低稀释度为1∶40,弱阳性血清的最低稀释度为1∶10(图4)。

图4 敏感性试验结果

2.7 重复性试验

用制备的试剂盒对5份ASFV阴性血清和5份阳性血清进行批内和批间重复试验,每份样品做5次重复检测(图5)。5份阴性血清的检测结果均为阴性,5份阳性血清的检测结果均为抗体阳性,对测得的批内和批间OD450 nm值进行统计学分析,批内CV为0.91%～3.41%,批间CV为1.31%～4.97%,CV均小于5%,具有良好的可重复性(表3)。

表3 批内和批间重复性试验结果

图5 重复性试验

2.8 符合率试验

用本研究建立的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法与进口的非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒(ID.Vet)同时对174份血清样品进行比对检测(表4),两种方法的阳性符合率为100%,阴性符合率为96.45%,总符合率为96.55%。

表4 符合性试验结果

3 讨论

疫苗免疫接种是预防和控制动物传染病最直接有效的措施,目前尚无商业化的ASF疫苗,感染低毒或中等毒力ASFV能产生抗体,可通过抗体存在与否作为诊断参考依据。最常用的血清学试验是ELISA,可检出感染低、中等毒力ASFV猪体内的抗体。除了基于p72蛋白建立的ELISA抗体检测方法,同样具有较高免疫原性的p30、p54蛋白也常作为检测抗原[14-17]。阻断ELISA是一种基于抗原和抗体之间的竞争性结合反应,包被抗原和酶标抗体的使用对于阻断ELISA的准确性和灵敏度至关重要。本试验用原核表达的ASFV p72重组蛋白作为固定在96孔板上的包被抗原。反应孔加入待检血清后,如待检血清中存在p72蛋白特异性抗体,就会与包被抗原发生反应,从而阻止下一步加入的HRP标记的特异性单克隆抗体与包被抗原结合,加入底物显色后通过酶标仪测定OD450 nm值、计算阻断率值来判定试验结果。阻断ELISA与间接ELISA相同点都是将抗原包被于96孔板上检测抗体,不同的是阻断ELISA中酶标抗体是与包被抗原结合,而间接ELISA中酶标抗体是二抗,与待检抗体结合。通常情况下,间接ELISA的敏感性高于阻断ELISA,但阻断ELISA的特异性更强,能有效减少非特异性反应和假阳性结果。

本研究所建立的阻断ELISA检测方法经过优化,确定阻断率临界值为50.12%,试验过程中所有已知ASFV抗体阳性血清的阻断率均高于50.12%,其他对照血清和阴性血清的阻断率均小于50.12%。试验结果显示本方法对ASFV强阳性血清的最低稀释度为1∶640,阳性血清的最低稀释度为1∶40,弱阳性血清的最低稀释度为1∶10。批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%,方法稳定,具有良好的重复性。总体而言,本方法具有特异性强、敏感性高以及适合大量样品快速检测等优点,为非洲猪瘟病毒抗体的监测和流行病学调查提供一种技术手段。