1,25-（OH）2D3 对慢性哮喘小鼠血清TGF-β、IL-4 水平的影响

黄丽娟，董德兴，谢剑露

（华中科技大学协和深圳医院，广东 深圳 518000）

支气管哮喘（Asthma）在我国的流行病学调查中结果不太乐观，用于治疗哮喘的药物也相对有限，对于预防哮喘的发生和防止哮喘患者气道重塑的药物更少。目前，在哮喘的治疗中糖皮质激素应用较为广泛，但由于患儿家长对儿童长期应用糖皮质激素的安全性存疑，因此导致糖皮质激素在儿童哮喘治疗中的使用程度不高。找到一种能替代糖皮质激素的药物，用于治疗小儿哮喘及改善哮喘患儿的气道重塑非常重要，也是目前的研究热点。现阶段，关于预防和改善哮喘患儿气道重塑药物的有效性仍需进一步探讨，需要大量的实验数据证实新药的有效性。研究表明，给予致敏小鼠慢性长时程激发可诱导出具有人类哮喘病理特征的哮喘动物模型［1］。本研究采用卵清蛋白（OVA）诱导建造慢性哮喘小鼠模型，并用1,25-二羟维生素D3﹝1,25-（OH）2D3﹞治疗慢性哮喘小鼠，然后检测其血清TGF-β、IL-4 水平，以期探索1,25-（OH）2D3抑制哮喘气道重塑的作用机制，详细报道如下。

1 材料和方法

1·1 实验动物

雌性、3 周龄BALB/c 小鼠30 只（购于广东省实验动物中心），体重15 ～19 g。将30 只小鼠随机分为3 组：正常对照组（10 只）、模型组（10 只）、维生素D 组（10只）。

1·2 试剂与药品

药品：1,25-（OH）2D3（美国Sigma 公司），OVA（美国Sigma 公司），氢氧化铝（美国Sigma 公司）；试剂：转化生长因子-β、白细胞介素-4 酶联免疫吸附试验（ELLSA）试剂盒（苏州四正柏生物科技有限公司）。

1·3 研究方法

模型组、维生素D组小鼠检疫3 d正常后分别于第1 d、第14 d 背部、腹腔注射OVA 混合液100 μg﹝OVA 100 μg+氢氧化铝1 mg+磷酸盐缓冲液（PBS）0·05 mL/只﹞，构建慢性哮喘小鼠模型。维生素D 组在第21 d 予1,25-（OH）2D3腹腔注射（100 ng/只，共18 次），30 min后予1% OVA 雾化吸入（隔天1 次，共18 次）；模型组予等量生理盐水腹腔注射，30 min 后予1% OVA 雾化吸入（隔天1 次，共18 次）。第55 d 收集标本，处死动物，采用ELLSA 检测各组的血清TGF-β、IL-4 水平，并予以比较。正常对照组常规饲养，不建模。

1·4 造模观察

造模小鼠在给予OVA 激发初始阶段表现为气促、点头呼吸、打喷嚏、腹肌收缩、烦躁等哮喘发作症状，随着0VA 诱导次数的增加，小鼠出现毛色光泽度下降、反应迟钝、进食减少和体重下降表现。

1·5 统计学方法

采用SPSS 19·0 统计软件对数据进行统计学分析。两变量间的相关性采用线性相关风险分析。计量数据以±s表示，两组间比较采用组成设计的t检验，多组间比较采用单因素方差分析及两两比较的q 检验。P＜0·05为有统计学差异。

2 结果

2·1 三组小鼠血清TGF-β、IL-4 水平的比较

血清TGF-β、IL-4 水平对比，维生素D 组较模型组明显降低（P＜0·05）；维生素D 组和模型组较正常对照组明显升高（P＜0·05）。详见表1。

表1 三组小鼠血清TGF-β、IL-4 水平的比较（±s）

表1 三组小鼠血清TGF-β、IL-4 水平的比较（±s）

注：与正常对照组比较，☆P ＜0.05；与模型组比较，◇P ＜0.05。

组别 TGF-β（μg/L） IL-4（ng/mL）正常对照组（n=10） 27.81±1.31 61.32±2.62模型组（n=10） 39.33±1.53☆ 89.12±2.91☆维生素D 组（n=10） 33.12±1.68☆◇ 73.66±2.63☆◇

2·2 相关性分析

慢性哮喘小鼠血清中TGF-β 与IL-4 呈正相关（r=0·856，P＜0·05）。

3 讨论

哮喘的发病机制较为复杂，尚未完全清楚。目前认为哮喘发病主要是因为Th1 型细胞功能和数量不足，Th2 型细胞占优势是其重要特征。哮喘患者体内的Th2型细胞主要产生IL-4 等细胞因子，这些细胞因子可导致免疫球蛋白E（IgE）抗原特异性增强，而IgE 抗原特异性增强可引起肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的分化、聚集等，进而启动哮喘气道炎症并保持气道炎症持续存在。Th1 和Th2 型细胞因子之间占比不均衡和生物功能的不平衡会引起免疫功能紊乱，从而导致哮喘发作。因此，维持Th1 和Th2 型细胞因子间的平衡对于哮喘的治疗至关重要。1,25-（OH）2D3是一种活性很强的物质，同时也属于类固醇激素，具有调节体内钙磷代谢、抗炎以及调节免疫功能等作用。1,25-（OH）2D3不仅在肾脏中生成，在人体其他器官中也能生成，例如在肺组织中广泛表达，此外在一些细胞中如肺泡巨噬细胞、气道上皮细胞中也广泛存在，并且局部合成的1,25-（OH）2D3在调节免疫系统功能上承担着重要的角色[2-3]。关于1,25-（OH）2D3能否在人体内产生生物学活性，主要取决于机体内维生素D 受体（VDR）是否正常。正常情况下，VDR 能与1,25-（OH）2D3结合，使其发挥良好的生物学效应。新近的研究表明，VDR 基因是哮喘的易感基因，提示1,25-（OH）2D3可能在某种程度上通过与VDR 的配体-受体效应参与对哮喘的调节[4]。目前研究发现，1,25-（OH）2D3在哮喘的免疫应答、慢性气道炎症、气道平滑肌细胞相关基因的调控方面均发挥着复杂的调控作用[5-6]。1,25-（OH）2D3通过上述作用，能够有效抑制哮喘患者的气道高反应和气道重塑。

IL-4 细胞因子是在T 细胞培养上清液中被发现的，现命名为白细胞介素-4，是第5 号染色体上的基因。成熟IL-4 分子由氨基酸残基组成，其生物学效应强。IL-4能激活B 淋巴细胞合成IgE 和免疫球蛋白G（IgG），上调可溶性低亲和力IgE 受体的表达，而IgE 与肥大细胞、嗜酸性粒细胞相互作用释放炎症介质，产生气道高反应，引起哮喘发作[7-8]。IL-4 可促使Th1 型细胞因子向Th2型细胞因子转化，通过对Th2 细胞强有力的催化以增强体液免疫。由此可见，IL-4 是诱导Th2 细胞分化的主要细胞因子［9-10］。IL-4 也是强大的致炎因子，能促使Th2细胞处于极化状态，引起上皮细胞过度增生、杯状细胞分化和黏液产生、气道内嗜酸性粒细胞浸润和聚集、气道平滑肌收缩及气道纤维化，最终导致气道高反应及气道重塑[11-12]。支气管哮喘本质上是一种以Th2 细胞免疫应答为主的气道重塑，而气道重塑在本病的发展、转归和预后中起着重要作用。本实验通过建造慢性哮喘小鼠模型，并检测其血清IL-4 水平，发现模型组小鼠的血清IL-4 水平较正常对照组高；给予1,25-（OH）2D3干预后发现，维生素D 组小鼠的血清IL-4 水平较模型组低。可见，1,25-（OH）2D3可有效治疗哮喘，其治疗机制主要是减轻气道高反应及抑制气道重塑。

TGF-β 可由体内的多种细胞分泌产生，它是多功能细胞活性调节因子中活性最强的因子，在炎症调节、干细胞及T 细胞的调节和分化中起着重要作用。TGF-β 在正常人体内呈低表达，一旦机体出现炎症反应或应激反应，TGF-β 的表达就会迅速升高。既往对支气管哮喘患者进行肺泡灌洗发现，TGF-β 在肺泡灌洗液和支气管中含量均很高。TGF-β 是导致哮喘患者气道结构改变的关键转化生长因子，TGF-β 基因表达水平与哮喘的严重程度相关[13-14]。TGF-β 是由调节性T 细胞分泌的重要因子之一，并参与调节性T 细胞的发育，当调节性T 细胞分化不足及出现功能缺陷时，过敏性疾病就会发生[15]。在哮喘的炎症反应中，TGF-β 能抑制T 淋巴细胞向Th2 细胞转化，通过增加转录因子Fox P3 的表达促进调节性T 细胞的分化，间接抑制Th2 细胞所导致的免疫反应，减少嗜酸性粒细胞的浸润[16]。TGF-β 是公认的致纤维化的转化生长因子，而纤维化的过程是导致气道重塑的重要原因[17-18]。哮喘患者气道的多种病理生理过程均有TGF-β 的参与，包括免疫细胞趋化、细胞凋亡、细胞分化和增殖、气道上皮和内皮屏障功能改变等，而上述过程均与哮喘的发病机制相关。本研究应用1,25-（OH）2D3治疗慢性哮喘小鼠，发现维生素D 组的血清TGF-β 水平显著高于正常对照组（P＜0·05）；模型组的血清TGF-β水平显著高于维生素D组（P＜0·05）。提示1,25-（OH）2D3能有效阻止哮喘患者体内TGF-β 的表达，并能延缓气道重塑过程，这与相关文献[17-18]报道的结果基本一致。本研究还发现慢性哮喘小鼠血清中TGF-β 与IL-4 呈正相关（r=0·856，P＜0·05），说明两者之间存在一定的联系。

综上所述，1,25-（OH）2D3能下调慢性哮喘小鼠的血清TGF-β、IL-4 水平，故推测1,25-（OH）2D3抑制气道重塑的作用机制可能与调节血清中TGF-β、IL-4 的含量有关。慢性哮喘小鼠在1,25-（OH）2D3的作用下导致血清TGF-β 水平降低，使Th2 极化水平下降。同时，在1,25-（OH）2D3的干预下，慢性哮喘小鼠的血清IL-4 水平下降，进一步促使Th2 细胞诱导的免疫反应下降，两者水平的降低可调整Th1/Th2 免疫细胞因子水平，使其重新恢复动态平衡，从而减轻气道炎症，延缓气道重塑。