猪伪狂犬病毒特点及分离鉴定

王秀丽，薄智勇，王艳凤，郭宝，陈学杰，战玉清

（青岛易邦生物工程有限公司 山东青岛 266113）

仔猪感染本病后主要表现为高热、腹泻、嘶鸣以及四肢划水等精神症状，可造成患病仔猪较高的死亡率；公猪感染本病后，主要会对生殖系统产生严重损伤，表现为睾丸炎，精液品质降低等情况；成年猪或者育肥猪感染本病后，在初期会有明显的高热现象，随后出现呼吸困难等症状，即使是耐过后的猪只，仍然会在一定时期内带毒，呈现隐性感染情况；若是妊娠期的母猪感染本病，则容易发生流产、死胎或者木乃伊胎等情况，若控制不当或者未能及时控制住疫情蔓延，则会给生猪养殖业带来非常严重的危害，在实际的养殖生产过程中，需加强对猪伪狂犬病毒的分离鉴定工作，进而为后续的诊疗提供可靠的依据。随着生物科学技术的不断发展，猪伪狂犬病毒的检测方法也在不断地更新，当前实验室检测中常用的包括中和试验、酶联免疫吸附等均能够将病毒进行有效区分、鉴别，为养殖场病毒的净化和生物安全防控提供可能。

1 猪伪狂犬病毒的特点

1.1 病原特性

猪伪狂犬病毒（PRV）是疱疹病毒科的一种双股线性DNA 病毒。该病毒颗粒的外形呈圆形或者椭圆形，外覆囊膜，并且在囊膜表面具有放射状排列的8～10 nm 长的纤突结构，病毒粒子的直径在110～150 nm 之间。该病毒对外界环境的抵抗力较强，可在液体当中或者物体表面存活7 d 以上，在pH 为4～9 的环境当中，仍然可以维持比较稳定的形态，病毒粒子耐热，但经紫外线照射后会快速失活，使用甲醛或者一些脂溶性的消毒制剂均可令其快速失活，可使用浓度为0.5%～1%的氢氧化钠溶液消毒，能够将其有效灭活。该病毒分布广泛，在世界范围内均有猪伪狂犬病毒感染发生，常见的猪、牛、猫、犬等动物均对其敏感，同时对水貂也具有一定的致病性[1]。

1.2 流行特点

该病毒会引发猪伪狂犬病毒病，患病猪只和隐性带毒猪是本病的主要传染源，健康易感猪只若接触到这些传染源则非常容易发生感染。该病毒主要是经过破损的皮肤、消化道和呼吸道等途径进入到易感猪只的体内，特别是以空气传播为主。此外，母猪的乳汁、种公猪的精液以及带毒猪只的分泌物均可传播此病毒。

1.3 病毒基因组多样性

猪伪狂犬病毒的基因组大小在150 kb 左右，能够编码70～100种病毒蛋白，但该病毒属于DNA 病毒，整个基因组比较稳定，虽然流行范围非常广泛，但仅有一种血清型。目前在全世界范围内分离的猪伪狂犬病毒只有genotype Ⅰ和genotype Ⅱ型2 个基因型，并且在不同的毒株之间，致病能力和毒力也存在着很大的不同。

2 猪伪狂犬对养猪业的危害

如果养殖场没有做好相关的疫病防控措施，则非常容易诱发场内猪只的感染，严重威胁到生猪的健康发育和生产性能，给养殖者带来严重的经济损失。

2.1 对种猪的危害

临床发现，种公猪感染猪伪狂犬病后，会导致精液带毒，在交配过程中即可传播给母猪。若母猪感染本病，则会对其胎盘造成严重的危害，还可直接侵入子宫内诱发胎儿感染，导致胎儿早夭；如果是妊娠早期的母猪感染本病，则母猪子宫内的胚胎会被吸收掉，导致母猪出现假怀孕的情况，影响母猪正常的返情率；母猪若是在妊娠中期发生感染，则会出现流产、死胎等情况。此外，还可能导致种猪永久的丧失配种能力。

2.2 对生长育肥猪的危害

如果是在正常的饲养阶段的育肥猪发生感染，则会诱发患猪咳嗽、呼吸困难等现象，还可能增加继发猪肺疫和猪副嗜血杆菌病的几率，导致患病猪只生长发育缓慢，严重的还可能停止生长，成为僵猪，严重影响饲养效率，造成经济损失。

2.3 对断奶仔猪的危害

断奶仔猪感染本病后，主要表现为腹泻、食欲降低和高热等临床症状，但由于个体差异，有些患猪还可能出现眼球外翻、咳嗽、呼吸急促和角弓反张等情况，严重影响其正常的生长发育。

2.4 对哺乳仔猪的危害

该病毒还可以通过乳汁和尿液等途径传播，引发较强的感染性，通常来说4 周龄以下的哺乳仔猪自身免疫能力较差，非常容易受到病原微生物的侵袭，出现食欲废绝、高热以及呼吸困难等情况，随着病情的进一步发展，还会表现出神经症状，最终引起死亡。

3 猪伪狂犬病毒的分离鉴定

3.1 病毒的分离培养

无菌条件下采集病死患猪的肺、脑等组织器官的样本，并将其进一步捣碎、匀浆处理，随后可根据说明书加入适量的Hank's 平衡盐溶液，混合均匀后制备成为混悬液，离心后取上清液，无菌条件下微孔滤膜过滤，同时加入适量的链霉素或者青霉素等抗生素，避免被其他细菌污染，然后将最终的混合物放在-40 ℃的环境中保存。吸取含有上述病料的混悬液1 mL，接种在生长状态良好的PK-15 细胞的细胞瓶当中，同时设置阴性对照组，将两组培养基同时置于37 ℃的环境中培养1 h 左右，随后再添加10 mL 左右的细胞维持液，再进行48 h 的培养后，观察其生长状态。经过多次传代培养，待细胞发生病变的时间稳定后，方可停止传代，将该培养物在-40 ℃的环境当中进行保存[2]。

3.2 病毒的鉴定

1）中和试验。将样本血清进行连续的倍比稀释，然后与病毒毒株进行1:1 的混匀，在37 ℃的环境中静置1 h 左右，随后在96 孔板当中进行猪肾继代细胞或者鸡胚成纤维细胞的培养，将上述血清病毒的混合物接种到培养的细胞当中，在37 ℃，含有5%的CO2的环境中静置培养，观察细胞的病变程度，同时对照说明书，判断血清的中和效价，若数值≥0.5，则可判定为阳性，否则为阴性。但这种检测方法工作量比较大，并且操作较为复杂，实验中的细胞和技术等条件对检测结果的影响比较大，也在一定程度上制约了该检测方法的实际应用。

2）酶联免疫吸附法（ELISA）。该检测方法是世界动物卫生组织（WOAH）推荐，血清学诊断致病原的首要方法，也是当前实验室检测当中应用最为广泛的一种检测方法。这种检测方法具有较高的敏感性，并且特异性较强，操作也较为简单，能够快速、准确的检测出样品结果，同时还适合对大批量的样品进行检测。随着我国生物科学的不断发展，已经出现了比较成熟的检测方法，例如gEELISA 和gE-LAT 等，均具有较高的敏感性，同时还能够对自然感染病毒的猪只与疫苗免疫的猪只进行区分，适用于猪伪狂犬病的临床诊断。

3）间接免疫荧光技术（IFA）。该方法适用于实验室内对特定病原进行诊断，主要是应用了抗原与抗体能够进行特异性结合的特点，将已知的抗体与病原相结合，充分混合后，将没有进行结合的抗体使用洗涤液洗去，再利用荧光标记好的抗体，与这些抗体结合，最后观察结果时需要用到荧光显微镜，若抗原和抗体发生了特异性结合反应，则可以观察到荧光现象，如果没有结合，则无法观察到荧光现象。该方法既可以检测病原的存在，也可以用于检测致病原在特定的组织或者细胞中的分布，灵敏性与特异性较强。

4）聚合酶链式反应（PCR）。随着多种针对PRV 核酸检测技术的研发与应用，通过将特定的核酸片段指数扩增后，可以更加精确、特异的鉴定出目标片段是否存在。当前使用较多的是实时定量PCR（RT-PCR）、多重PCR 以及环介导等温扩增（LAMP）等检测技术。在对猪伪狂犬病的临床检测中，多使用多重PCR 技术，这种检测方法操作简单、敏感性较高，检测速度也比较快，同时还可与其他病毒进行有效区分，也可以对混合感染的患猪进行检测。而实时定量PCR 则具有快速、敏感等优点，可实现实时定量检测，还可以同时对大量样本进行检测。环介导等温扩增则是一种新兴的检测技术，比较适用于样品的现场检测，适用范围更加广泛，在反应速度方面更有优势，相较于传统PCR，具有更高的灵敏度与特异性[3]。

5）核酸探针技术。该方法是一种常用的分子生物学检测技术，主要通过分子杂交等手段，将基因组的DNA 进行标记，同时以重组质量作为探针，将致病原进行特异性的鉴定、检测。或者使用基因芯片，制备得到相应的基因芯片，可获得更高的灵敏度，同时可将质量好的芯片留作重复使用。该检测技术的特异性非常高，能够实现将猪细小、猪伪狂犬等病毒进行同时检验、区分，也可以对基因缺失苗和野生毒株进行有效区分，该检测方法具有较好的应用前景。

4 结语

猪伪狂犬病是猪养殖业当中一种常见的急性传染性疫病，可对患病猪只的正常生长发育造成较大的负面影响，甚至危害到猪只的生命健康，造成较高的死亡率，给养殖者带来严重的经济损失。本病的传播范围广泛，并且呈现一定的散发趋势，若养殖场内发现相关病例出现，则往往难以彻底将该病毒清除，需要将阳性感染的猪只全部淘汰才能彻底阻断本病毒的传播，否则很容易在养殖场内发生反复性感染，造成重大损失。为了对本病进行有效防控，需加大对养殖场内病毒流行情况的监测，及时淘汰带毒的猪只，加强养殖场的清洁、消毒管理制度，积极开展相应的防护措施，促进生猪养殖业的健康快速发展。■