基于网络药理学和分子对接颠倒泻心汤治疗慢性萎缩性胃炎的作用机制

刘 姣 刘卿辉 游运舸

慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis, CAG）是由于胃黏膜上皮反复遭受炎症或其他刺激导致胃腺萎缩，黏膜层变薄，腺体数目减少，归属于胃癌前状态[1]。胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，延缓或逆转Correa 模式（萎缩性胃炎-肠化生-异型增生-胃癌）[2]是预防胃癌发生发展的重要措施。有研究发现，CAG 患者胃黏膜的血流灌注量相对浅表性胃炎患者更低，提示胃黏膜腺体萎缩可能与胃内血流灌注低相关[3]，胃黏膜胃镜下表现是胃腑气血是否充盛的直接体现，CAG 胃镜下可见黏膜皱襞变平，血管显露，胃黏膜红白相间，以白为主，伴有结节状或颗粒样表现[4]。“胃黏膜以白为主”是脾胃虚弱、胃络失养之象，为CAG 中医病理基础；“结节状或颗粒样改变”可归属为“胃内癥瘕”。有学者提出胃癌前病变即微癥瘕，微者小也，此微癥瘕为极小癥瘕，非肉眼所能见也[5]。

CAG 常呈虚实夹杂、本虚标实之象，以脾胃虚弱为本，气滞痰凝血瘀为标。血瘀是CAG 久病的主要病机[6]，在胃黏膜萎缩演化成胃癌的过程中起着重要作用。在CAG“升降失司、气血失和”的中医病机基础上，再灵活运用“微癥瘕”理论，将半夏泻心汤与颠倒木金散联合起来，组成颠倒泻心汤治疗CAG。本研究基于网络药理学和分子对接就颠倒泻心汤治疗CAG 的作用机制进行分析。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 颠倒泻心汤药物活性成分及作用靶点的筛选

分别对颠倒泻心汤中的党参、大枣、甘草、法半夏、黄芩、黄连、干姜、木香、郁金、莪术10 种药物使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）进行检索，设置OB≥30%，DL≥0.18，获得有效成分后通过其MOL.ID 号搜寻单味药成分作用靶点。利用uniprot（http://www.uniprot.org/）数据库下载化合物数据表格，匹配靶点基因名。最后将化学成分的相关靶点蛋白利用Uniprot 数据库，对其进行注释。筛选掉没有靶点的无效成分。

1.2 筛选疾病相关靶点和颠倒泻心汤治疗CAG 的潜在靶点

在GeneCards、OMIM 数据库中输入关键词“Chronic Atrophic Gastritis”，查找CAG 疾病相关靶点，剔除重复基因，合并后即为本研究的疾病靶点。运用Venny 2.1 在线绘图工具将“1.1”和“1.2”获取的基因取交集后，最终获得颠倒泻心汤治疗CAG的潜在靶点。

1.3 中药成分-靶点-疾病网络图的构建

将交集靶点、药物成分数据导入Cytoscape 3.9.0作图软件，进行网络拓扑学分析，根据基因的连接数量（Degree 值）调整靶点图形、颜色、透明度和大小，构造“成分-靶点-疾病”网络图。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将潜在靶点导入String 平台，获取蛋白质相互作用关系。将结果导入Cytoscape3.9.0 软件中，选择“network Analyzer”，得到网络拓扑学参数。然后把下载好的TSV 文件导入cytoscape 软件做PPI 图，其中节点越大、颜色越红代表Degree 值越大，根据Degree 值筛选出排名前10 的核心靶点。

1.5 基因本体（gene ontology, GO）生物过程和京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析

利用Bioconductor 在R 软件内安装运行Pathview、clusterProfiler 和Stringin 程序包，对其进行生物学过程的GO、KEGG 通路富集分析，得到的数据中，pvalue 值越大表示富集程度越大，选取排名前10 的GO 值、排名前15 及与疾病相关的KEGG 值绘制条形图。

1.6 分子对接

将拓扑学参数排名靠前的大分子和小分子进行分子对接。蛋白质晶体结构由 alphafold 数据库（https://alphafold.ebi.ac.uk/）获取。对接小分子库由搜索TCMSP 数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中的中药获取并建立。运用Autodock 程序完成分子对接后，将结果导入pymol 进行可视化。

2 结果

2.1 颠倒泻心汤药物活性成分及靶点的筛选

共筛选得到234 种药物成分，删除70 种无对应靶点蛋白的化合物，将12 种多药物共有成分去重整合后，得到141 种药物活性成分。在TCMSP 数据库对141 种药物有效成分MOL.ID 进行搜索，共获得2 262 个药物作用的靶点蛋白，经过去重处理后，剩余236 个。利用Uniprot 数据库匹配236 个靶点蛋白对应基因名。

2.2 筛选疾病相关靶点和颠倒泻心汤治疗CAG 的潜在靶点

从Genecards 数据库、OMIM 数据库查找筛选CAG 疾病靶点，去重整合后，最后得到933 个疾病靶点，与236 个药物作用靶点进行韦恩分析，最终得到101 个交集靶点（图1），作为颠倒泻心汤治疗CAG 的潜在关键靶点。

图1 “中药靶标基因-疾病基因”韦恩图

2.3 成分-靶点-疾病网络的构建

为了进一步探索颠倒泻心汤治疗CAG 的作用机制，将101 个潜在关键靶点与236 个药物作用的靶点蛋白比对，去除无对应的药物成分，最终获得16 种药物活性成分，将其与101 个交集靶点的数据导入Cytoscape 3.9.0 软件，构建成分-靶点-疾病网络图（图2），图中不规则四边形节点代表疾病名称、菱形节点代表药物靶点及疾病交集靶点、正六边形节点代表药物活性成分。选择Analyze network 选项分析网络中的节点，最终得到各节点的度值。药物活性成分对应的交集靶点越多度值越高，按照度值高低选择排名前5 的药物活性成分作为颠倒泻心汤治疗CAG 的核心成分（图3）。

图2 成分-靶点-疾病网络

图3 核心成分

2.4 PPI 网络的构建

通过String 平台获取蛋白质相互作用关系，导入Cytoscape 3.9.0 作图软件进行PPI 网络构建（图4），该图共有96 个节点和456 条边。节点越大、颜色越红代表Degree 值越大。根据Degree 值筛选出前10的核心靶点（图5）。

图4 PPI 网络

图5 核心靶点

2.5 GO 功能富集分析

GO 富集分析共获得4 530 条，其中生物过程（BP）3 915 条、细胞组成（CC）251 条、分子功能（MF）364 条，根据富集的基因数量各取排名前10的条目进行可视化，图中条形长度代表富集的基因数量。见图6。

图6 GO 富集结果

2.6 KEGG 通路富集分析

共获得符合筛选标准的条目232 条，按照P值进行排序，选取基因数前15 的条目及与CAG 密切关联的MAPK、JAK-STAT、胃癌、PI3K-Akt 及幽门螺杆菌感染中的信号通路进行可视化，图中条形的长度代表相应条目所富集基因数量（图7）。涉及通路包括脂质和动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、TNF信号通路、肝细胞癌、胰腺癌、肝炎等。

图7 KEGG 通路富集结果

2.7 分子对接

从“图3”中选取前3 的核心成分槲皮素（Quercetin）、黄芩素（baicalein）和β-胡萝卜素（beta-carotene），从“图5”中选择度值排名前3 的靶蛋白STAT3、JUN 和AKT1，将其分别进行结合能力预测（表1），形成的对接模型的结合能均小于-5 kcal/mol，说明结合活性较好。

表1 关键靶点与成分对接结果

3 讨论

CAG 属于中医学“胃痞”，中焦虚弱，外邪渐深，由气入血，直至胃络，最终形成“胃内癥瘕”。胃络失养，胃腺萎缩，胃黏膜变薄，日久成萎。其中，胃络瘀阻是本病的关键病理环节。若病理提示肠化生或异型增生，则更应重视，其性乖戾，久稽于胃，若不积极治疗，可恶变成癌。

CAG 的临床治疗目标应在改善患者临床症状的基础上，尽量延缓或阻滞“炎-癌”转化进程[7]。颠倒泻心汤中郁金辛苦，辛能散能行，苦能燥能泄，且又入血分，能行气解郁，活血止痛，以化瘀为主；木香味辛性温，辛散温通，主入气分，行气止痛，调中导滞，以理气为要，二药相须配伍，疏肝行气、活血通络，临床常用于治疗气滞血瘀之证。党参、甘草、大枣甘温益气，以补脾虚。中虚失运，升降失调，又以半夏散结除痞、和胃降逆，黄芩、黄连泄热开痞，干姜温中散寒。此四药相伍，具有寒热平调、辛开苦降之效。莪术消积止痛、破血消癥，现代药理学表明，莪术的主要物质基础“莪术油”具有广泛的抗肿瘤作用[8]，可有效防治癌前病变、肠上皮化生及非典型增生。

药效成分方面，槲皮素可以促进黏膜愈合，发挥抗炎、抗氧化效用，是一种潜在的抗胃黏膜炎症的生物活性物质[9]；喻春红等[10]的研究表明采用槲皮素治疗后大鼠胃黏膜炎症显著减轻，胃黏膜病理明显转归，可对CAG“炎-癌”转化产生防治作用。黄芩素不仅具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗肿瘤等功效[11]，还能通过抑制细菌繁殖和减弱细菌致病力发挥抗幽门螺杆菌的作用[12]。黄芩素也能通过抑制炎症因子的释放从而阻断其对胃黏膜的损伤[13]。段雲霄等[14]的研究表明，黄芩素能显著抑制胃癌HGC-27 细胞增殖，其作用随时间和浓度依赖性增加。β-胡萝卜素可以有效改善CAG 的临床症状，并逆转“炎-癌”转化进程[15]。已有研究[16]证实β-胡萝卜素可以通过调控STAT3 等多条信号通路发挥抗肿瘤作用。

治疗靶点方面，STAT3 是一种转录因子，也是JAK/STAT 信号通路的最终蛋白，其可进入核内发挥促转录的作用，研究已证实STAT3 的过表达可以促进胃癌细胞的转移[17]。进一步的细胞生物学行为的研究结果表明STAT3 能够促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭[18]。崔姗姗[19]在研究中发现半夏、黄芩、黄连及干姜均能通过抑制STAT3 转录因子下游基因的表达，从而诱导胃癌细胞SGC-7901 凋亡。多项动物实验[20-21]均证实了抑制STAT3 信号通路及以其介导的IL-1β 和TNF-α 促炎因子表达，可使胃内炎症微环境得到改善，加快细胞凋亡，最终达到治疗CAG的目的。骆梅[22]在研究中证实了JUN 能与DKK1启动子结合，促进DKK1 启动子的活性，激活DKK1-PI3K/AKT/mTOR 信号通路从而促进胃癌细胞的增殖和侵袭。AKT1 可通过调控PI3K/Akt 等多条信号通路诱导胃癌细胞凋亡[23]。李树静等[24]以WNT/β-Catenin 信号通路为切入点，从细胞水平证实了AKT1 可能通过调节MMP-9 蛋白的表达，促进胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

结合“成分-靶点-疾病”网络图分析结果可知，颠倒泻心汤可作用于FOS、IL6、TP53、MAPK1、TNF、MAPK3 及MAPK14 等多靶点，其中TP53 不仅是CAG 的关键靶标，也是肠化生、不典型增生的监测指标[25]。MAPK3 过度表达及活化可以使下游STAT3 水平升高，从而诱导胃癌细胞的增殖、转移和侵袭[26]。TNF-α 和IL6 等炎症因子过表达会损伤胃黏膜，且表达程度与损伤程度成正比，可影响CAG的发展与转归[27-28]。

颠倒泻心汤作用于CAG的癌症通路有P53、TNF及胃癌通路等；炎症通路有IL-17 信号通路、NF-κB、EGFR 及幽门螺杆菌感染中的上皮细胞信号传导通路等；与代谢相关的通路有脂质和动脉粥样硬化、AGE-RAGE 信号通路等；与CAG 密切相关的有JAK-STAT 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、MAPK信号通路等。PI3K-Akt 信号通路可以调控细胞增殖，积极参与肿瘤的转移和扩散。抑制PI3K/AKT 信号通路介导的细胞扩散能延缓“炎-癌”转化并减少胃癌细胞的增殖和分化[29]。MAPK 信号通路可以调控多种细胞的增殖与凋亡[30]。通过降低胃黏膜中MAPK水平，促进CAG 细胞凋亡，起到治疗CAG 的作用。众多研究发现CAG 的发病与炎症因子密切相关[31-33]，JAK-STAT 信号通路可以促进IL-6 和TNF-α 等炎症因子的释放，导致胃黏膜受损[34]。

综上所述，颠倒泻心汤可能通过调节细胞增殖与凋亡、免疫炎症反应、脂质代谢、致癌因子等多途径治疗CAG。脂质和动脉粥样硬化信号通路是KEGG 通路富集分析结果中基因数量最多的通路，这与上文提到的CAG“微癥瘕”理论相符，或许可为CAG 下一步研究提供新思路。