基于网络药理学研究活血接骨胶囊治疗闭合性腰椎骨折的作用机制

郑维宣 范鸣翔 伍英杰 刘振洋 罗建松 许和贵

骨折是指骨的完整性或连续性遭受破坏，腰椎骨折是脊柱外伤中最常见的一种骨折类型[1]。本病多发于成年人及存在骨质疏松症的老年人，尤其以绝经后的女性为高发病人群。随着城市化的快速发展，在我国腰椎骨折的发病率逐渐上升，不仅影响患者的生命质量，还带来了沉重的经济负担[2]。腰椎骨折主要以闭合性腰椎骨折为主，主要临床表现为腰背局部疼痛、压痛、叩击痛，腰部活动受限，严重者可能会出现大小便失禁及下肢截瘫[3]，若不及时处理容易导致休克。对于闭合性腰椎骨折患者主要采用手术治疗[4]，解除脊髓或神经压迫，纠正畸形并恢复脊椎稳定性，须及早进行治疗避免造成进一步的损伤。患者术后容易出现术区伤口疼痛、肿胀，老年患者伤口愈合缓慢。腰椎骨折术后患者配合中药活血接骨胶囊内服能有效改善血液循环，减轻腰背部疼痛，促进骨折加速愈合，改善脊柱活动度，提高患者日常活动能力。活血接骨胶囊是由贵州中医药大学第一附属医院骨伤科时光达教授根据临床经验研制后经本院改良而成[5]。活血接骨胶囊主要由苏木、透骨草、土鳖虫、自然铜、川芎、丹参、骨碎补、熟地黄等中药组成，具有续筋接骨、消肿止痛、活血祛瘀等功效，主治跌打损伤、筋伤骨折、瘀肿疼痛等[6]。现代药理学研究表明，活血接骨胶囊能够减轻炎症反应，增强成骨细胞和破骨细胞的活性，促进伤口愈合[7]。然而，活血接骨胶囊治疗闭合性腰椎骨折的网络药理学研究目前尚未见相关报道。基于此，本研究基于网络药理学就活血接骨胶囊治疗闭合性腰椎骨折的作用机制进行分析。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 获取活血接骨胶囊的活性成分及靶点

于中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中分别输入“苏木”“透骨草”“土鳖”“自然铜”“川芎”“丹参”“骨碎补”“熟地黄”，限定OB≥30%、DL≥0.18，再结合NCBI数据库（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/）、CNKI 数据库（https://www.cnki.net/）、BATMAN 数据库检索并筛选出8 味中药的活性成分及靶点。限定物种为“Homo sapiens”，采用Uniprot 数据库（http://beta.uniprot.org/）筛选出活血接骨胶囊活性成分对应的靶点，转换成与之相对应的基因名称，删减重复项并整合，最终获得活血接骨胶囊的活性成分及其靶点数据集。

1.2 获取疾病的靶点

以“Closed lumbar fracture”为关键词在Genecards 数据库（http://www.genecards.org/）和OMIM 数据库（https://omim.org/）中检索闭合性腰椎骨折的靶点，将上述获得的闭合性腰椎骨折的靶点进行整合，删除重复项后即获得闭合性腰椎骨折疾病的靶点集。

1.3 构建“药物-成分-靶点”网络

将筛选出的活血接骨胶囊活性成分的作用靶点与闭合性腰椎骨折疾病靶点导入在线网站venny 2.1，绘制韦恩图并筛选出交集靶点。采用cytoscape 3.8.2软件将中药及其活性成分和与之对应的靶点构建“药物-成分-靶点”网络。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建

将“1.3”项下筛选出的交集靶点导入String 数据库，选择物种为“Homo sapiens”，置信度≥0.9，隐藏没有相互连接的边，导出.tsv 文件，采用cytoscape 3.8.2 软件对.tsv 文件进行可视化分析，绘制PPI 网络图。

1.5 核心靶点的筛选

将String 数据库中的.tsv 文件导入cytoscape 3.8.2 软件，计算拓扑参数，选择degree 值大于4 倍中位数，介度中心性（BC）和接近中心性（CC）均大于其相应中位数的节点作为核心靶点。

1.6 基因本体（GO）富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路分析

将“1.5”项下筛选出的核心靶点，导入DAVID数据库对其进行GO 富集分析和KEGG 信号通路分析，可以获得活血接骨胶囊治疗闭合性腰椎骨折的GO 生物学过程和关键信号通路。

2 结果

2.1 活血接骨胶囊的活性成分及靶点

通过数据库结合文献检索共筛选出活性接骨胶囊117 个活性成分，其中苏木有21 个，透骨草有13个，土鳖有1 个，自然铜有1 个，川芎有6 个，丹参有58 个，骨碎补有15 个，熟地黄有2 个；通过Uniprot 数据库，共筛选出654 个药物靶点。

2.2 疾病的靶点

采用Genecards 数据库和OMIM 数据库共得到闭合性腰椎骨折疾病靶点2 662 个，与活血接骨胶囊的共同靶点有264 个（图1）。

图1 活血接骨胶囊与闭合性腰椎骨折靶点的交集

2.3 PPI 网络

将“1.3”项下的活血接骨胶囊与闭合性腰椎骨折的交集靶点导入String 数据库，将其结果的.tsv 文件导入Cytoscape 3.8.2 软件得出节数点为247、边数为8 734，根据Degree 值大小绘制其PPI 网络。见图2。

图2 PPI 网络

2.4 “药物-成分-靶点”网络

将活血接骨胶囊中的各味中药、活性成分、靶点导入cytoscape 3.8.2 软件构建“药物-成分-靶点”网络（图3），结果显示：该网络共有788 个节点、1 987 条边。网络图中显示，同一活性成分可作用于不同靶点，而不同活性成分也可共同作用于同一靶点，体现了活血接骨胶囊治疗疾病时具有多成分多靶点协同作用的特点。

图3 “药物-成分-靶点”网络

2.5 核心靶点

运用Cytoscape 3.8.2 软件对交集靶点进行拓扑分析，并选取Degree＞40 的候选核心靶点29 个，最后采用BC＞9.65，CC＞0.69 筛选出STAT3、JUN、MAPK1、NR3C1、FOS、HDAC1、MAPK14、SP1、RELA、TP53 10 个核心靶点。见图4。

图4 核心靶点筛选流程

2.6 GO 富集分析

活血接骨胶囊治疗闭合性腰椎骨折的GO 生物过程分析结果显示，涉及共132 条GO 生物过程，包括生物学过程（BP）79 条，细胞组成（CC）16 条，分子功能（MF）37 条，绘制各类别前10 条目的柱状图见图5。结果显示，主要涉及了药物反应、蛋白结合、基因的正表达、RNA 聚合酶Ⅱ转录调控、酶的结合、细胞因子活性等生物学过程，体现了活血接骨胶囊可通过调控多个复杂的生物过程来治疗闭合性腰椎骨折。

图5 GO 富集分析柱状图

2.7 KEGG 信号通路分析

KEGG 信号通路分析结果显示：活血接骨胶囊治疗闭合性腰椎骨折的信号通路有96 条，按照-lgP值排序，选取前30 条通路绘制靶点通路分类图见图6，结果显示主要包括TNF 信号通路、TOLL 样受体信号通路、AGE-RAGE 通路、MAPK 信号通路、IL-17通路、癌症通路、乙肝通路、Th17 细胞等信号通路。

图6 KEGG 信号通路

同一靶点可调控不同的信号通路如：STAT3、JUN、MAPK1、NR3C1、FOS、HDAC1、MAPK14、SP1、RELA、TP53 等靶点可参与调控TNF 信号通路、TOLL 样受体信号通路、AGE-RAGE 通路、MAPK信号通路、IL-17 通路、癌症通路、乙肝通路、Th17细胞等，提示活血接骨胶囊通过作用于多条通路来治疗闭合性腰椎骨折。见图7。

图7 信号通路桑葚图和气泡图

3 讨论

活血接骨胶囊主要含有苏木、透骨草、土鳖虫、自然铜、川芎、丹参、骨碎补、熟地黄等中药材，诸药合理配伍，具有续筋接骨、消肿止痛、活血祛瘀等功效，主治跌打损伤、筋伤骨折、瘀肿疼痛等疾病[5-6]。临床研究发现苏木、透骨草、骨碎补具有明显的抗炎止痛作用，能降低炎症因子水平从而缓解术后疼痛及肿胀；土鳖虫、自然铜两味中药具有良好的续筋接骨作用，配合使用能促进骨折早期愈合；丹参、川芎活血化瘀，具有改善机体血液微循环作用，祛瘀生新加速骨折部位气血运行，从而缩短骨折愈合时间；熟地黄滋阴补血，益精填髓，可营养骨骼，使骨变得更坚硬牢固[7]。

腰椎骨折属于中医“骨折病”范畴，主要临床表现为伤处刺痛肿胀、腰椎活动受限。骨折后常采用内固定手术进行治疗，目的是通过重建脊柱稳定性，恢复脊柱功能，改善骨折后临床症状[8]。腰椎骨折使用内固定手术治疗的过程易耗伤人体气血，术后易导致气血升降失调，运行不畅；气血相互相乘，气行则血行，气滞则血瘀；气不摄血，则血溢脉外形成瘀血，瘀血停留在局部，不通则痛，可见患者术后伤口处疼痛肿胀。高龄患者本身肝肾亏虚，气血津液生成匮乏，术后更容易导致气血津液不足[9-10]，可见骨折愈合缓慢，如果给予中药活血接骨胶囊治疗能够有效缓解术后症状。

通过对活血接骨胶囊中的有效成分进行分析发现，部分化合物如山柰酚、槲皮素、隐丹参酮、木犀草素、芹菜素及双氢黄酮苷等已被证实具有抗炎镇痛和促进成骨细胞增殖作用。赵峰等[11]通过实验研究发现山柰酚可上调miR340-5p 抑制AKT3 表达，从而阻断AKT3/mTOR 信号通路，抑制星形胶质细胞的炎症，增强自噬，减轻脊神经结扎大鼠的神经性疼痛。山柰酚可通过调控Wnt/β-catenin 经典途径调节骨的发育和矿化[12]；山柰酚具有促进成骨细胞MG-63 增殖和矿化的作用[13]。槲皮素可通过上调SATB2 基因的表达促进BMSCs 增殖和成骨分化[14]；槲皮素通过抑制DANCR 的表达促进BMSCs 的增殖和成骨分化[15]；有研究发现槲皮素还可通过活性氧抑制MAPK 途径的激活，影响心肌成纤维细胞增殖来抑制心脏纤维化[16]。木犀草素具有消炎、抗菌、抗病毒等功效，能有效抑制巨噬细胞磷酸化，降低转录因子NF-kB 的活性，减少脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞分泌细胞因子IL-6、TNF-a。其可通过调控TLR4/NF-κB 途径减少炎症反应的发生，从而治疗某些疾病[16]。芹菜素可以促进MC3T3-E1 细胞成骨分化和矿化[17]；芹菜素能促进干细胞成骨分化[18]；芹菜素作为活血补肾方治疗骨关节炎的药效物质基础，能降低骨关节炎的炎症反应从而达到治疗骨关节炎的作用等[19]。双氢黄酮苷可促进骨骼对钙离子的吸收，改善血液循环、新陈代谢，从而促进骨折早期愈合[10]。

通过对活血接骨胶囊PPI 网络和富集分析，核心靶点为STAT3、JUN、MAPK1、NR3C1、FOS、HDAC1、MAPK14、SP1、RELA、TP53 等，主要通过干预TNF信号通路、TOLL 样受体信号通路、AGE-RAGE 通路、MAPK 信号通路、IL-17 通路、癌症通路、乙肝通路、Th17 细胞等相关信号通路治疗闭合性腰椎骨折。槲皮素通过调控ERK1/2-MAPK 信号通路，下调MAPK mRNA 和蛋白的表达，从而对骨质疏松有明显预防作用[20]；槲皮素、木犀草素、山柰酚等化合物作为淫羊藿中的活性化合物，作用于多靶点如JUN、IL6、TNF、TP53 调控多条信号通路治疗骨质疏松[21]；芹菜素在治疗骨折方面的机制可能与调节OPG/RANKL/RANK 信号通路有关。研究发现使用芹菜素处理创伤性骨折大鼠模型，可以减轻大鼠炎症反应并促进骨折愈合[22]。双氢黄酮苷可通过调控多通路促进骨折愈合[10]。

综上所述，活血接骨胶囊中的药物在治疗骨折、筋伤等疾病时，每一味药物均发挥着巨大作用，具有显著临床疗效。网络药理学研究发现活血接骨胶囊主要通过TNF 信号通路、TOLL 样受体信号通路、AGE-RAGE 通路、MAPK 信号通路、IL-17 通路、癌症通路、乙肝通路、Th17 细胞等途径治疗闭合性腰椎骨折。但本研究只是在分子机制方面进行了探讨预测，具体药物作用机制仍需进一步相关实验进行验证。