雪茄烟叶工业发酵过程中霉变对真菌群落结构的影响研究

黄阔,朱贝贝,叶长文,邹梦影,李栋,李东亮,李青常,薛芳

1.中国烟草总公司郑州烟草研究院,河南 郑州 450001;

2.四川中烟工业有限责任公司 雪茄烟技术创新中心,四川 成都 610066;

3.四川中烟工业有限责任公司 长城雪茄厂,四川 德阳 618400

0 引言

雪茄烟是一种以晾晒烟叶为原料进行发酵后制成的传统烟草制品[1]。然而初次发酵的雪茄烟叶因香气透发性不足、杂气较明显,仍需通过工业发酵进一步分解转化烟叶内部物质,以提升烟叶的工业可用性[2]。工业发酵能提高雪茄烟叶品质、彰显雪茄风格特色,是改善雪茄烟叶外观品质、物理特性、吸食品质的关键[3]。在雪茄烟叶工业发酵过程中,微生物起着重要作用[4-5]。研究表明[6-7],雪茄烟叶表面微生物数量较多,大致可分为细菌、真菌、放线菌、病毒等,其中真菌除在雪茄烟叶发酵过程中发挥重要作用外,还有可能引起雪茄烟叶霉变,降低雪茄烟叶品质[8-10]。如闫铁林等[11]研究发现,雪茄烟叶表面存在大量真菌,以青霉属和曲霉属为主要真菌;周家喜[10]研究发现,青霉属和曲霉属是引起烟叶霉变的主要霉菌。

以往对雪茄烟叶中微生物种类的研究,主要是利用传统微生物学方法对可培养微生物进行分离鉴定,然而绝大多数微生物难以培养,导致研究结果不能全面反映样品中微生物群落的真实组成[12-13]。近年来,基于Illumina MiSeq的高通量测序技术已广泛应用于烟草微生物研究[14-15]。该方法不仅简化了传统微生物学检验的繁琐过程,并且为大量不可培养微生物的研究提供了有效手段,促进了烟草微生物研究的新进展,也为提升烟叶优质发酵生产提供了新途径[1,16-18]。

目前对于雪茄烟叶工业发酵过程中微生物的研究,主要集中于微生物对雪茄烟叶品质的提升,而对雪茄烟叶发酵过程中霉变现象及微生物对霉变发生的影响涉及较少。鉴于此,本研究拟以德雪一号雪茄烟叶工业发酵过程中正常烟叶和霉变烟叶为研究对象,使用基于Illumina MiSeq的高通量测序技术研究样品中霉菌数量及真菌群落结构的变化规律,以期从微生物群落结构变化角度解析烟叶霉变原因,为雪茄烟叶霉变防控提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

主要材料:德雪一号茄芯烟叶,产自四川什邡,于温度10～30 ℃、相对湿度(65±10)%环境条件下存放。在温度(20±5)℃,相对湿度(60±10)%环境条件下进行烟叶备料,并于温度(30±5)℃,相对湿度(65±10)%环境条件下发酵40 d。分别于发酵第0 d、15 d、30 d、40 d进行取样,样本编号分别为F0、F15、F30、F40。发酵第30 d时除对正常样品取样外,还发现霉变样品开始出现并同步取样,编号为FM30。每次取样250 g,每个样品3个重复,取样后迅速将样品带回实验室冷冻保存。

主要试剂:孟加拉红琼脂培养基、磷酸盐缓冲液、无菌培养皿、无菌L型涂布棒和无菌均质袋,广东环凯微生物科技有限公司;E.Z.N.A.®DNA提取试剂盒,美国Omega公司;AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒,美国Axygen Biosciences公司。

主要仪器:Bagmixer®400型均质器,法国Interscience公司;HZT-2000型电子天平,福州华志科学仪器有限公司;CL-40 M型高压灭菌锅,日本AUTOCLVAE公司;SCAN 1200型自动菌落计数器,法国Interscience公司;VORTEX1型涡旋振荡器,德国IKA公司;CTHI-250B2型恒温恒湿箱,上海施都凯仪器设备有限公司;T-100型PCR扩增仪,美国Biorad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 霉菌计数方法参照《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》(GB 4789.15—2016)[19]和《烟草及烟草制品 微生物学检验 霉菌计数》(YC/T 472—2013)[20],并对部分步骤进行改进。称取25 g雪茄烟叶,剪碎后置于含225 mL磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中,均质器3挡均质3 min,按10-1、10-2、10-3、10-4的体积比用水稀释,并将各梯度稀释液涂布接种于孟加拉红琼脂培养基表面,标记后置于温度(28±1) ℃,相对湿度(75±1)%的恒温恒湿培养箱内正置培养5 d,进行各平板生长霉菌的判读和计数。

1.2.2DNA提取、PCR扩增和测序分别称取雪茄烟叶样品各0.5 g,按照DNA提取试剂盒操作说明进行雪茄烟叶微生物群落总DNA提取。选择上游引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′),下游引物ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)对所提取DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系为20 μL;扩增参数为95 ℃预变性3 min,36个循环(95 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s),72 ℃总延伸10 min。采用2.0%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测,将合格的PCR产物进行纯化回收,并送至上海美吉生物医药科技有限公司进行Illumina MiSeq高通量测序。

1.3 数据处理

分别采用Fastp软件和Flash软件对原始序列进行质控和拼接;利用Usearch软件对所得序列进行过滤,去除嵌合体序列,得到有效序列;通过Uparse软件在97%的相似性水平上划分操作分类单元(OTU);利用Unite分类学数据库对OTU进行物种注释分析;利用t检验(P<0.05)分析样本中α多样性和差异物种,筛选具有显著性差异的微生物菌群(相对丰度>1%)。

采用Excel 2010进行数据处理;利用SPSS 17.0进行单因素ANOVA方差分析及Duncan显著性检验(P<0.05);使用Origin 2018制图。

图1 雪茄烟叶工业发酵过程中霉菌数量变化Fig.1 Mold content changes during the fermentation process of cigar leaf industry

2 结果与分析

2.1 雪茄烟叶工业发酵过程中霉菌数量变化

雪茄烟叶工业发酵过程中霉菌数量变化如图1所示,图中不同小写字母表示样品间差异显著(P<0.05)。由图1可知,5个样品中均有霉菌检出,其中发酵前样品中的霉菌含量最低,为60 CFU/g,发酵第30 d的霉变样品中霉菌含量最高,达到8.3×104CFU/g。发酵开始后,各阶段样品中霉菌含量不但均显著高于发酵前样品,而且也存在显著性差异。但发酵结束后,霉菌含量较发酵第30 d时的正常样品显著降低,这可能是发酵后期氧气含量下降,温度、湿度的变化不适于霉菌生长所致。以上结果表明,霉菌含量与霉变风险密切相关。雪茄烟叶工业发酵过程中霉菌含量在前中期呈显著增加趋势,在后期呈降低趋势,在霉菌含量较高的发酵中后期(15～40 d)存在较大霉变风险。

2.2 雪茄烟叶工业发酵过程中真菌群落结构变化

2.2.1α多样性分析雪茄烟叶工业发酵过程中真菌群落α多样性指数如图2所示,c)中*表示0.01

图2 雪茄烟叶工业发酵过程中真菌群落α多样性指数Fig.2 Alpha diversity index of fungal community during the fermentation process of cigar leaf industry

2.2.2OTU聚类分析以97%的相似性水平对各样品进行OTU聚类分析,测序结果表明,共获得优化序列620 056条,平均序列长度225 bp。物种注释统计结果表明,5个样品检出的真菌分布在4个门、12个纲、18个目、26个科、35个属和48个种,各样品在不同分类水平的真菌群落数量见表1。

雪茄烟叶工业发酵过程中真菌群落Venn图如图3所示。由图3可知,各样品中OTU数量分别为46、39、45、34和46,其变化规律与群落多样性变化规律相似,发酵第30 d的霉变样品中OTU数量最少,发酵第0 d及发酵第40 d的样品中OTU数量最多,5个样品中所共有的OTU为23个,在97%相似性水平上共检出OTU数量65个。

2.2.3 物种组成分析雪茄烟叶工业发酵过程中门水平真菌群落平均相对丰度如图4所示。由图4可知,在门水平上,平均相对丰度大于1%的真菌菌群仅有子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota)。子囊菌门占绝对优势,其次为担子菌门。子囊菌门在发酵第30 d的样品中所占比例高达99.82%。担子菌门在发酵第40 d的样品中所占比例明显增加,达到31.56%。这与邢蕾等[24]的子囊菌门、担子菌门为雪茄烟叶发酵中优势菌门的研究结果一致。

表1 不同分类水平真菌群落数量Table 1 The number of fungal communities of different classification levels 个

图3 雪茄烟叶工业发酵过程中真菌群落Venn图Fig.3 Venn diagram of fungal community during the fermentation process of cigar leaf industry

雪茄烟叶工业发酵过程中属水平真菌群落平均相对丰度如图5所示。由图5可知,在属水平上,平均相对丰度大于1%的真菌菌属有曲霉属(Aspergillus)、unclassified_f__Aspergillaceae、节担菌属(Wallemia)、链格孢属(Alternaria)、匍柄霉属(Stemphylium)、Sagenomella、耐旱霉属(Xeromyces)。在发酵第30 d的霉变样品中,曲霉属占绝对比例,平均相对丰度为92.32%。

图4 雪茄烟叶工业发酵过程中门水平真菌群落平均相对丰度Fig.4 Relative abundance of fungal communities at the phylum level during the fermentation process of cigar leaf industry

图5 雪茄烟叶工业发酵过程中属水平真菌群落平均相对丰度Fig.5 Relative abundance of fungal communities at the genus level during the fermentation process of cigar leaf industry

雪茄烟叶工业发酵过程中属水平真菌群落Heatmap图如图6所示。由图6可知,发酵第0 d及发酵第15 d的样品中真菌物种组成较为相似,发酵第30 d与发酵第40 d的样品中物种组成结果基本一致,这也与属水平上5个样品的群落组成相似。物种组成与发酵时段有关,相邻发酵时段真菌物种组成较为相似,随发酵时间延长,物种组成差异性逐渐变大,且霉变雪茄烟叶与正常雪茄烟叶的物种组成差异性更大。

图6 雪茄烟叶工业发酵过程中属水平真菌群落Heatmap图Fig.6 Heatmap of genus level fungal community during the fermentation process of cigar leaf industry

图7 雪茄烟叶工业发酵过程中属水平样品组间差异显著性检验Fig.7 Significance test of differences between groups of each sample at the genus level during the fermentation process of cigar leaf industry

2.2.4 组间差异物种分析雪茄烟叶工业发酵过程中属水平样品组间差异显著性检验结果如图7所示。由图7可知,曲霉属、unclassified_f__Aspergillaceae、Sagenomella、耐旱霉属、Phialosimplex、尾孢菌属(Cercospora)及unclassified_f__Sporidiobolaceae在5个样品中均具有显著性差异,且曲霉属的平均相对丰度最高,在发酵第30 d的霉变样品中相对含量高于其他样品。结合优势菌属及组间差异物种分析结果发现,曲霉属不仅是霉变样品的优势菌属,还在发酵第30 d的样品中平均相对丰度最高,表明其与雪茄烟叶工业发酵过程中的霉变发生密切相关。这与周家喜[10]的研究结果一致,曲霉属为烟叶霉变的优势菌属,拥有较强的致霉能力,也与叶长文等[1]基于高通量测序的雪茄烟微生物群落结构和多样性的分析结果较为一致。曲霉属在雪茄烟叶整个工业发酵过程中均为主要优势菌属,且在霉变雪茄烟叶中占比更高。研究[25-27]表明,随着真菌(曲霉属)的生长,它们会分泌各种酶,分解和消化组织成分,释放包括CO2、真菌毒素和抗菌剂在内的代谢产物,引起霉变反应,本研究中也发现曲霉属可能是引起雪茄烟叶霉变的关键菌属。但也有研究[28-29]表明,曲霉属具有隔绝空气、抑制有害菌生长、改善烟叶品质等功能,如高文霞等[30]从烟叶中分离到一株曲霉属菌株SZ14,用该菌处理烟叶后,烟叶中有机酸和石油醚提取物含量明显增加,感官评吸得分显著提高。因此,本研究虽发现曲霉属在雪茄烟叶工业发酵过程中与霉变发生密切相关,但其对烟叶品质的综合影响仍有待进一步深入探究。

3 结论

本文以德雪一号茄芯雪茄烟叶为研究对象,采用Illumina MiSeq高通量测序技术分析雪茄烟叶工业发酵过程中正常烟叶和霉变烟叶真菌微生物群落结构的变化规律。结果表明:1)雪茄烟叶工业发酵过程中霉菌含量不断增加,霉变会导致雪茄烟叶真菌物种丰富度、多样性及OTU数量降低。2)雪茄烟叶工业发酵过程中,优势菌门为子囊菌门和担子菌门,优势菌属为曲霉属、unclassified_f__Aspergillaceae、节担菌属、链格孢属、匍柄霉属、Sagenomella和耐旱霉属。3)曲霉属是具有组间显著性差异的优势菌属,与雪茄烟叶工业发酵过程中霉菌含量及霉变发生密切相关,是引起雪茄烟叶霉变的主要真菌菌属,下一步霉变防控可对曲霉属进行重点关注。未来将开展雪茄烟叶中曲霉属微生物种类及其生物学特性研究工作,结合雪茄烟叶发酵工艺特点,制定更具针对性的雪茄烟叶防霉策略。