香榧油-薯蓣皂素油凝胶的制备及其结构和消化特性研究

朱鹏浩,谢润华,李佳玲,余宁翔,聂小华,孟祥河,陆元超

浙江工业大学 食品科学与工程学院,浙江 杭州 310014

0 引言

作为全球人口死亡主要原因之一的心血管疾病,每年死亡病例超过1700万例[1]。研究[2-3]发现,饱和脂肪酸和反式脂肪酸的摄入是诱发心血管疾病的原因之一;世界卫生组织推荐反式脂肪酸的摄入量应小于总能量摄入量的1%,饱和脂肪酸的摄入量不应超过总能量摄入量的10%[4]。因此,众多膳食指南均建议低脂饮食、增加不饱和脂肪酸摄入、降低饱和脂肪酸和反式脂肪酸摄入。固体脂肪含有较多饱和脂肪酸和反式脂肪酸,为降低固体脂肪的摄入,选择健康的替代品对其进行替代是一项行之有效的措施。油凝胶是一种利用凝胶剂三维网络限制液体油流动的黏弹性物质,且具有零反式和低饱和度的优点[4-5],能较好地替代固体脂肪。

香榧油(Torreyagrandisoil,TGO)是一种从香榧种仁中提取的高附加值油脂产品,主要含有棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1(n-9))、亚油酸(C18∶2(n-6))、亚麻酸(C18∶3(n-3))、金松酸等脂肪酸[6-7]及维生素E、角鲨烯等生物活性物质,具有降血脂、抗炎、抗肿瘤等生理活性[8-11],是一种极具研究与应用价值的高品质油脂。目前,对TGO的研究主要集中于提取、品质指标评估等。如S.S.Wen等[7]研究发现,微波预处理水酶法能极大提升TGO的清油得率,且TGO保持了较高品质。温思思等[10]研究发现,通过上调甘油三酯分解代谢关键酶及下调甘油三酯合成代谢关键酶,金松酸能显著抑制细胞甘油三酯的蓄积。

研究[12-14]表明,油凝胶的理化性质和消化特性与凝胶剂类型、油脂链长、油脂不饱和度、制备方法等密切相关,且油凝胶中油脂的来源亟需扩大。基于此,本文拟以TGO为油相,以薯蓣皂素(Diosgenin,DSG)为凝胶剂,采用直接法制备TGO-DSG油凝胶(TDOG油凝胶),研究TDOG油凝胶的微观结构、流变特性、质构特性、晶体结构、化学连接等,并比对TDOG油凝胶与TGO的消化特性,以明确TDOG油凝胶的形成原理及凝胶化对TGO消化特性的影响,以期为TGO的高值化深加工及TDOG油凝胶替代固体脂肪提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

DSG(纯度>98%),武汉拉那白医药化工有限公司;胃蛋白酶(15 000 U/g)、脂肪酶(30 000 U/g,来源于猪胰)、胆盐(胆酸含量≥60%),上海源叶生物科技有限公司;KCl、KH2PO4、NaCl、MgCl2·(H2O)6、(NH4)2CO3、CaCl2·(H2O)2、HCl、NaOH,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;TGO(主要脂肪酸含量为:7.6% C16∶0,3.0% C18∶0,33.9% C18∶1(n-9),42.0% C18∶2(n-6),0.7% C18∶3(n-3),2.2% C20∶2,9.3%金松酸),实验室压榨法自制。

1.2 主要仪器与设备

DF-2000型集热式恒温加热磁力搅拌器,杭州庚雨仪器有限公司;BH200P型偏光显微镜,浙江舜宇光学科技(集团)有限公司;BA210 Digital型光学显微镜,厦门麦克奥迪实业集团有限公司;MCR302型流变仪,奥地利安东帕集团;TA.XT.Plus型质构仪,英国Stable Micro Systems公司;Ultima Ⅳ型X射线衍射(XRD)仪,日本理学公司;iS50型傅里叶红外光谱(FTIR)仪,美国赛默飞世尔科技公司;THZ-82型恒温振荡器,国华(常州)仪器制造有限公司;7890A型气相色谱仪,安捷伦科技(中国)有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1TDOG油凝胶制备参照课题组前期研究[12,14],称取1 g DSG分散至19 g TGO中,于90 ℃条件下加热搅拌直至得到澄清透明溶液,将该溶液置于25 ℃环境下冷却至固体状态,即制得TDOG油凝胶。

1.3.2 微观结构表征将TDOG油凝胶在90 ℃条件下加热溶解,同时将载玻片预热;取10 μL TDOG溶液滴在预热的载玻片上,于25 ℃环境中放置24 h后,利用光学显微镜和偏光显微镜观察TDOG油凝胶的微观结构。

1.3.3 流变特性测定使用配有水循环温控系统和平行板(直径为25 mm,间隙为1 mm)的流变仪表征TDOG油凝胶的流变特性。

1)应变扫描。通过应变扫描确定TDOG油凝胶的线性黏弹区(Linear Viscoelastic Region,LVR)。恒定剪切频率为1 Hz,剪切应变范围为0.001%～10%,测试温度为25 ℃。

2)频率扫描。在LVR范围内的低应变条件下进行测定。恒定应变为0.01%,频率范围为0.01～100 Hz,测试温度为25 ℃。

3)温度扫描。恒定应变为0.01%,恒定频率为1 Hz,温度变化范围为20～100 ℃,升温速率为3 ℃/min,获得储能模量(G′)和损耗模量(G″)随温度的变化曲线。

4)剪切速率扫描。剪切速率范围为0.01～100 s-1。获得的流动曲线采用如下幂次定律拟合:

η=Kγn-1

式中,η为表观黏度/(Pa·s);K为一致性指数/(Pa·Sn);γ为剪切速率/(s-1);n为流动性指数。

1.3.4 质构特性测定取适量TDOG油凝胶于质构仪中,选用圆柱形探头P-0.5(直径为 10 mm),测前速度为2.0 mm/s,测中和测后速度均为1.0 mm/s,下压深度为10 mm,测试温度为25 ℃,测定硬度、粘附性和咀嚼度。

1.3.5 晶体结构表征取适量TDOG油凝胶于配套载玻片上,采用配备Cu～Kα辐射(λ=1.54 Å,电压40 kV,电流40 mA)的XRD仪表征DSG和TDOG油凝胶的晶体结构。扫描范围2θ为3°～50°,扫描速率为5°/min,步长为0.02°。

1.3.6 化学连接表征利用FTIR仪表征DSG、TGO和TDOG油凝胶的化学连接。将DSG和KBr烘干至恒重后,采用KBr压片法制备样品。取1～2 mg DSG干燥粉末,以质量比m(DSG)∶m(KBr)=1∶100加入KBr,研磨至粒度小于2 μm;将样品转移至压片模具中,压片机加压至8～10 MPa并维持2 min,将样品压成薄片后供检测使用。TGO和TDOG油凝胶采用配备ATR附件的FTIR仪进行检测。扫描范围为500～4000 cm-1,扫描次数为64次。

1.3.7 体外消化模拟实验参考M.Minekus等[13]的方法,并稍作修改。模拟胃液(Simulated Gastric Fluid,SGF)和模拟小肠液(Simulated Intestinal Fluid,SIF)由电解质储备液、酶等组成。SGF具体成分为6.9 mmol/L KCl、0.9 mmol/L KH2PO4、72.2 mmol/L NaCl、0.12 mmol/L MgCl2·(H2O)6、0.5 mmol/L (NH4)2CO3和0.09 mmol/L CaCl2·(H2O)2;SIF具体成分为6.8 mmol/L KCl、0.8 mmol/L KH2PO4、123.4 mmol/L NaCl、2.88 mmol/L MgCl2·(H2O)6、1.1 mmol/L (NH4)2CO3和0.36 mmol/L CaCl2·(H2O)2。

1)模拟胃消化。将0.25 g样品(TDOG油凝胶或TGO)与20 mL SGF混合,并用1 mol/L HCl溶液将pH值调节至3.0,加入胃蛋白酶,使最终消化系统中胃蛋白酶活力为2000 U/mL;将混合物在37 ℃水浴摇床振荡孵育2 h。

2)模拟小肠消化。向模拟胃消化后的样品中加入20 mL SIF,用1 mol/L NaOH溶液将混合物的pH值调节至7.5,加入胆盐和脂肪酶,使最终混合物中胆盐的浓度为10 mmol/L、脂肪酶活性为2000 U/mL;将混合物置于37 ℃水浴摇床振荡孵育2 h。利用0.01 mol/L NaOH溶液进行滴定,以脂肪酸释放率(Free Fatty Acid Released Rate,FFA)作为油脂水解程度指标来表征油脂或油凝胶的消化率,FFA/%计算公式如下:

式中,VNaOH为NaOH溶液消耗的体积/mL;CNaOH为NaOH溶液的浓度;Moil为TGO的平均相对分子质量/(g·mol-1);msample为样品的初始质量/g。

1.3.8 脂肪酸组成测定通过脂肪酸甲酯化测定TGO、TGO 120 min消化上清液、TDOG油凝胶120 min消化上清液中的脂肪酸组成。取500 μL样品于圆底烧瓶中,加入4 mL 0.5 mol/L的NaOH-甲醇溶液,于80 ℃水浴回流15 min后,加入5 mL质量分数为55%的三氟化硼-甲醇络合物,水浴回流2 min;取出圆底烧瓶,在室温下冷却后,加入2 mL正己烷和15 mL饱和NaCl,振荡15 s,转移至50 mL容量瓶中,继续加入5 mL正己烷,并用饱和NaCl定容至刻度线;将正己烷层过膜转移至气相小瓶中。

气相色谱条件为:进样量1 μL;进样器温度250 ℃;检测器温度260 ℃。柱温升温程序为起始温度120 ℃,保持1 min;以10 ℃/min的速率升温至175 ℃,保持10 min;以5 ℃/min的速率升温至210 ℃,保持5 min;以5 ℃/min的速率升温至230 ℃,保持8.5 min。根据脂肪酸甲酯的保留时间确定脂肪酸的峰位置。

1.4 数据分析处理

所有实验结果均进行3次重复实验,结果以(平均值±标准差)表示。方差分析采用SPSS Statistics V21.0软件,实验数值差异显著性采用Duncan法(P<0.05)分析。使用Origin Lab 2021b软件绘图。

2 结果与讨论

2.1 TDOG油凝胶微观结构分析

TDOG油凝胶照片及其微观结构如图1所示。由图1a)可知,DSG分散至TGO中,1 d后可形成倒置稳定的TDOG油凝胶,呈明显的固体状态。由图1c)—f)可知,TDOG油凝胶具有小而密的球状DSG结晶(见图1c)、e))和大而松散的球状DSG结晶(见图1d)、f))两种类型。经放大观察发现,两种TDOG油凝胶结晶周围均有针状绒毛结构,其中小而密的球状DSG结晶是由一系列细小纤维交叉连接形成的;大而松散的球状DSG结晶之间是由纤维连接形成三维网络,以实现对TGO的束缚[12,14]。此外,从TDOG油凝胶的典型偏光显微镜照片中发现:TDOG油凝胶的形成归因于DSG的结晶。众多纤维结晶构成的三维网络通过毛细作用、表面张力及节点之间的连接作用束缚液体油[14-15]。

图1 TDOG油凝胶照片及其微观结构Fig.1 Photographs and microstructure of TDOG oleogels

2.2 TDOG油凝胶流变特性和质构特性分析

TDOG油凝胶的流变特性如图2所示。由图2a)可知,TDOG油凝胶的LVR为0.001%～0.05%,临界应变点为0.05%。与其他油凝胶(质量分数均为5%的MAG-大豆油凝胶、米糠蜡-大豆油凝胶和β-谷甾醇/γ谷维素-大豆油凝胶)相比[16],TDOG油凝胶临界应变点较低,LVR较窄,是较脆的凝胶结构。这可能是由于TDOG油凝胶中球形DSG结晶间的连接点较少、交联较弱。因此,为确保TDOG油凝胶在其他流变特性探究过程中始终处于LVR,在后续研究中将剪切应变设为0.01%。

由图2b)可知,在频率为0.01～100 Hz的扫描条件下,TDOG油凝胶的G′远大于G″,呈现出固体性质,表明TDOG油凝胶成功制备[16]。但G′和G″随频率变化呈现的规律性较弱,这可能是由于TDOG油凝胶三维网络构建单元间的连接较弱,球形DSG结晶间是由物理作用力连接的。

温度熔化行为是油凝胶的重要功能特性之一。由图2c)可知,TDOG油凝胶的G′和G″整体上随着温度的升高而降低。这可能是由于温度升高致使球状DSG结晶部分溶解,球状DSG结晶间的连接概率降低,从而破坏TDOG油凝胶中的三维结晶网络。此外,TDOG油凝胶的相转变温度约为86.8 ℃,表明TDOG油凝胶具有一定的温度耐受力,这为TDOG油凝胶的实际应用与保存提供了理论支持。

表观黏度是油凝胶另一重要指标。由图2d)可知,随着剪切速率的增加,TDOG油凝胶的表观黏度不断下降,呈现出油凝胶典型的剪切稀化行为,表明TDOG油凝胶是假塑性流体[17]。此外,本研究通过幂次定律拟合出TDOG油凝胶表观黏度随剪切速率的变化情况。其中K表征前期黏稠度,K越大,越黏稠;n表征假塑性程度,n<1时,表明TDOG油凝胶为剪切稀化的假塑性流体。由图2d)可知,拟合函数的决定系数(R2)达到0.998,表明幂次方程拟合效果良好;K达到44.728 Pa·Sn,与其他油凝胶相比数值较低,表明TDOG油凝胶的黏稠度较低,与图2b)结果相符;n(为0.007)<1,表明TDOG油凝胶为剪切稀化的假塑性流体,与图2c)结果相符。

要替代固体脂肪,油凝胶就要具有一定可塑性、涂抹性和粘附性。TDOG油凝胶的硬度约为145.1 g,该数值处于合理的固体脂肪硬度范围内,能维持一定形状,具有较高的可塑性;TDOG油凝胶的粘附性约为107.7 g·s,该数值处于合理的固体脂肪粘附性范围内,因此TDOG油凝胶具有较好的粘附能力(与表观黏度结果相一致),也具有适宜的涂抹性;TDOG油凝胶的咀嚼度约为22.0,表明TDOG油凝胶具有合适的咀嚼性。因此,TDOG油凝胶具有优良的质构特性。

2.3 TDOG油凝胶的晶体结构和化学连接分析

TDOG油凝胶的典型XRD和FTIR图谱如图3所示。由图3a)可知,DSG中共有7个特征峰(6.95°、14.00°、14.76°、15.92°、16.84°、17.54°、18.46°),与前期[18]研究结果一致。当DSG于TGO中结晶形成TDOG油凝胶后,于19.92°处出现一个宽峰,代表TDOG油凝胶中TGO所形成的β晶型[19];此外,TDOG油凝胶保留了DSG的5个特征峰(7.00°、14.06°、16.84°、17.60°、18.48°),且与DSG的特征峰相比,TDOG油凝胶中DSG的峰值强度显著降低,特征峰数量减少,且峰位置发生偏移,表明TGO及其凝胶形成过程干预了DSG重结晶,使DSG结晶结构重排[18]。这也表明DSG与TGO的凝胶化是由范德华力等物理作用力导致的。

图2 TDOG油凝胶的流变特性图Fig.2 Rheological properties of TDOG oleogels

由图3b)可知,对于DSG,3451 cm-1处吸收峰对应甾环羟基的O—H伸缩振动,2951 cm-1处吸收峰为C—H伸缩振动,1051 cm-1、983 cm-1、1020 cm-1和962 cm-1处吸收峰对应五元或六元环中C—O—C基团的对称和反对称伸缩振动。对于TDOG油凝胶,在1053 cm-1处吸收峰为DSG中C—O—C的伸缩振动峰,未发现有新峰生成,表明TGO与DSG制备TDOG油凝胶的过程中未发生化学反应。综上所述,形成和维持TDOG的作用力主要是范德华力等物理作用力[20]。

2.4 TDOG油凝胶的体外消化模拟分析

TGO和TDOG油凝胶的脂肪酸释放曲线如图4所示。由图4可知,与TGO相比,TDOG油凝胶的消化率在0～45 min内是相当的;当消化时间超过60 min后,TDOG油凝胶的消化率明显低于TGO,在其他油脂与油凝胶研究中也发现了类似现象[21]。在0～45 min的消化时间内,TDOG油凝胶中未被紧密束缚的TGO从TDOG凝胶网络中游离出来,因而展现出与TGO类似的消化行为。然而,当消化时间继续延长,TDOG油凝胶中的游离TGO基本被消化完全,剩余被DSG三维网络束缚的TGO其消化需要先破坏DSG三维网络,才能与消化酶接触[21-22],因此,其消化率较低。

图3 TDOG油凝胶的典型XRD和FTIR图谱Fig.3 Typical XRD and FTIR profiles of TDOG oleogels

图4 TGO和TDOG油凝胶的脂肪酸释放曲线Fig.4 Fatty acid release curves of TGO and TDOG oleogels

此外,当消化时间为120 min时,TGO的消化率为50.9%而TDOG油凝胶的消化率为40.7%,为分析二者消化率差异的来源,本文对TGO、TGO 120 min消化上清液、TDOG油凝胶120 min消化上清液的主要脂肪酸组成进行了探究,结果见表1。由表1可知,相较于TGO,TGO 120 min消化上清液中的饱和脂肪酸(C16∶0、C18∶0)含量明显提升,且不饱和脂肪酸中,C18∶2(n-6)含量低于C18∶1(n-9);相较于TGO 120 min消化上清液,TDOG油凝胶120 min消化上清液中的饱和脂肪酸含量进一步提升,且C18∶2(n-6)含量远低于C18∶1(n-9)。上述结果表明,TGO中不饱和脂肪酸相较于饱和脂肪酸更不易被消化,这可能是由于脂肪酶与不饱和脂肪酸的亲和度较低;随着TGO不饱和度的提高,其消化难度进一步增大;此外,经DSG凝胶化后,TGO中不饱和脂肪酸的消化难度也进一步提高[21-22]。

表1 TGO、TGO 120 min消化上清液和TDOG油凝胶120 min消化上清液的主要脂肪酸组成Table 1 Primary fatty acids composition of TGO, TGO 120 min digestive supernatant and TDOG oleogels 120 min digestive supernatant %

3 结论

本研究通过直接法成功制备了TDOG油凝胶,并对其微观结构、流变特性、质构特性、晶体结构、消化特性等进行了研究,得到如下结论:TDOG油凝胶具有小而密的球状DSG结晶和大而松散的球状DSG结晶两种类型,主要由纤维连接形成的三维网络构建;TDOG油凝胶为典型的弱凝胶体系,呈现剪切稀化特征,其相转变温度约为86.8 ℃,这表明其具有较强的温度稳定性,有利于实际应用与保存;TDOG油凝胶中DSG三维结晶网络主要由范德华力等物理作用力形成;凝胶化可大幅降低TDOG油凝胶中TGO的消化率,且其不饱和脂肪酸更难被消化。本研究结果将为TGO的深加工与应用提供一定的理论指导,也证明了TDOG油凝胶在健康功能食品的研究与开发方面具有广阔的应用前景。