国内外典型茄衣烟叶常规化学成分和中性致香物质关键性差异指标研究

赵亮,王硕立,赵曦,王以慧,侯冰清,金一骁,王骏,时向东

1.浙江中烟工业有限责任公司 技术中心,浙江 杭州 310024;

2.河南农业大学 烟草行业烟草栽培重点实验室,河南 郑州 450002;

3.南阳市烟草公司西峡县分公司,河南 西峡 474599;

4.山东中烟工业有限责任公司 雪茄研究中心,山东 济南 250100

0 引言

茄衣烟叶是雪茄烟最外层的烟叶,约占雪茄烟总质量的10%[1],是判断雪茄烟品质和档次的重要指标[2]。在燃烧过程中,茄衣烟叶与空气最先充分接触,感官贡献度高于其质量所占比重[3],甚至能够直接影响整支雪茄烟的味道变化[4]。优质茄衣烟叶具有叶片薄、支脉细、颜色均匀、拉力强、燃烧性好、化学成分协调等特点[5],对土壤、气候等种植条件要求较高,目前仅巴西、多米尼加、印度尼西亚等少数国家生产的茄衣烟叶可用性较好[6-8]。为构建国产雪茄烟原料保障体系,我国海南、四川、云南、湖北、湖南等地已连续多年种植茄衣烟叶,但由于生态、土壤和生产技术的限制,目前国内尚未实现高品质茄衣烟叶的规模化生产,优质茄衣烟叶原料大多仍依赖进口[9]。国内雪茄烟市场发展势头强劲,但进口雪茄烟原料供应紧张,尤其是茄衣原料已成为我国雪茄烟工业生产中的“卡脖子”问题[10]。

近年来,有关茄衣原料的研究不断深入,研究者发现种植条件是影响茄衣原料品质的关键因素[11-12]。种植条件主要由所在地的气候条件提供,产区不同,茄衣原料品质会有较大差异。李爱军等[11]研究发现,海南茄衣的外观品质、物理特性等指标接近或达到印度尼西亚茄衣水平,但总植物碱及氯离子含量较高,多项感官评吸得分低于印度尼西亚茄衣。丁宁等[12]研究发现,不同产地马杜罗茄衣颜色的明度值和外观品质差异较小,墨西哥马杜罗茄衣钾含量最高,中国海南马杜罗茄衣烟碱含量最高,国外各产地马杜罗茄衣感官品质均优于中国海南马杜罗茄衣。不同产区茄衣烟叶中化学物质含量的差异是其风格特色形成的重要基础。鉴于此,本文拟基于偏最小二乘判别分析(PLS-DA)法分析国内外茄衣烟叶常规化学成分和中性致香物质的关键性差异指标,并采用Pearson相关性分析法对其进行相关性研究,以期为优化茄衣烟叶生产技术、推进国产茄衣原料开发与应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

收集40份国内外不同产区的茄衣烟叶,其中国内茄衣烟叶20份(海南茄衣烟叶3份、四川茄衣烟叶3份、云南茄衣烟叶6份、湖北茄衣烟叶4份、湖南茄衣烟叶4份),国外茄衣烟叶20份(印度尼西亚茄衣烟叶10份、多米尼加茄衣烟叶4份、巴西茄衣烟叶6份),具体信息见表1。

主要试剂:二氯甲烷、无水乙醇,天津市富宇精细化工有限公司;柠檬酸、无水硫酸钠,天津市大茂化学试剂厂;乙酸苯乙酯,上海麦克林生化科技股份有限公司。以上试剂均为分析纯。

主要仪器:AA3型全自动间断式流动分析仪,英国SEAL分析仪器有限公司;Trace GC Ultra-DSQII气相色谱-质谱联用仪,美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1 待测样品制备取不同产区茄衣烟叶共40份,每份30片,在45 ℃下烘干,研磨过0.25 mm筛网(60目),用于常规化学成分和中性致香物质的测定。

1.2.2 常规化学成分测定参照烟草行业标准[13-17]测定烟叶样品中总氮、总糖、还原糖、烟碱、氯和钾的质量分数。

表1 茄衣烟叶样品信息Table 1 List of samples of wrapper tobacco leaves

1.2.3 中性致香物质测定1)内标溶液配制:称取0.600 g乙酸苯乙酯,用无水乙醇稀释定容至100 mL,再取5 mL稀释液用无水乙醇定容至200 mL,作为内标溶液。

2)待测样品制备:于1000 mL圆底烧瓶中加入20.0 g烟叶样品粉末、2.0 g柠檬酸和600 mL蒸馏水,置于同时蒸馏装置一侧,另一侧250 mL圆底烧瓶中加入40 mL二氯甲烷和1 mL内标溶液,同时置于50 ℃水浴中,打开通水阀,待样品沸腾分层时计时2.5 h,收集有机相。有机相中加入10 g无水硫酸钠,摇匀澄清后转移至鸡心瓶中,并置于60 ℃水浴中浓缩至1 mL。

3)待测样品分析:气相色谱-质谱联用仪中的色谱柱为HP-5(60 m×250 μm×0.25 μm);载气为He,流速为0.8 mL/min;进样口温度为250 ℃,传输线温度为280 ℃;离子源温度为177 ℃;升温程序为在40 ℃保留2 min,然后以8 ℃/min的速率升温至240 ℃,保留15 min;不分流进样,进样量为1 μL;电离能为70 eV,电离方式为EI;扫描范围为35～500 amu。利用NIST02谱库对中性致香物质检索定性,采用内标法对中性致香物质定量[18]。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2019和DPS 9.01软件进行数据处理与显著性分析。PLS-DA是基于偏最小二乘回归法的一种有监督判别方式,可有效区分组间观察值,并找到导致组间差异的影响变量[19]。本文采用SIMCA 14.1软件对国内外茄衣烟叶常规化学成分和中性致香物质进行分析,建立相应PLS-DA模型,以筛选关键性差异指标。采用层次聚类分析直观展示关键性差异指标的分布规律。采用Pearson相关性分析法分析关键性差异指标间的相关性。使用Origin 2021软件制图。

2 结果与分析

2.1 常规化学成分分析

国内外茄衣烟叶常规化学成分分析结果见表2。由表2可知,国内茄衣烟叶总糖质量分数、还原糖质量分数分别为0.79%、0.42%,均显著高于国外茄衣烟叶;印度尼西亚、巴西、多米尼加烟叶总糖和还原糖质量分数较为接近。巴西烟叶钾质量分数为5.04%,显著高于其他国家;但国内茄衣烟叶钾质量分数与多米尼加、印度尼西亚烟叶较为接近。国内茄衣烟叶总氮质量分数为3.14%,显著低于国外茄衣烟叶;烟碱质量分数为3.81%,显著高于巴西(1.21%)和印度尼西亚烟叶(1.58%)。国内茄衣烟叶钾氯比与巴西、印度尼西亚较为接近,均显著低于多米尼加烟叶。巴西烟叶糖碱比、氮碱比均显著高于其他国家。国内茄衣烟叶糖碱比显著高于多米尼加烟叶,氮碱比与多米尼加烟叶较为接近,但显著低于巴西和印度尼西亚烟叶。

2.2 中性致香物质分析

国内外茄衣烟叶中性致香物质含量如图1所示,其中,不同小写字母表示在P<0.05水平上有显著性差异。由图1可知,国内外茄衣烟叶中性致香物质含量差异较大,国内茄衣烟叶中性致香物质总含量最高,显著高于印度尼西亚烟叶,但与巴西、多米尼加茄衣烟叶无显著性差异。中国、多米尼加与印度尼西亚茄衣烟叶类胡萝卜素降解产物含量较为接近,均显著高于巴西茄衣烟叶。国内外茄衣烟叶的苯丙氨酸类降解产物含量无显著性差异。巴西烟叶类西柏烷类降解产物含量最高,显著高于其他国家烟叶。国内茄衣烟叶棕色化反应产物含量最高,并显著高于其他国家。新植二烯降解生成的植物呋喃有助于形成烟叶的清甜成分,对烟草香气有重要的贡献,但新植二烯本身不具备香气,且刺激性大,其含量过高会增加烟叶生青气,因此含量应适宜[20]。国内茄衣烟叶中新植二烯含量较高,推测其与国内部分烟叶的刺激性较强和杂气含量较高有直接关系[21],且新植二烯含量会随着调制时间的增加呈先增加后减少趋势[22],因此建议在国内茄衣烟叶农业生产过程中加强调制技术,拉长调制时间,适当降低新植二烯含量。

表2 国内外茄衣烟叶常规化学成分分析Table 2 Analysis of conventional chemical constituents in domestic and foreign wrapper tobacco leaves

图1 国内外茄衣烟叶中性致香物质含量Fig.1 The content of neutral aromatic substances in domestic and foreign wrapper tobacco leaves

2.3 常规化学成分和中性致香物质关键性差异指标筛选及分析

图2 国内外茄衣烟叶常规化学成分和中性致香物质PLS-DA模型得分分布Fig.2 Distribution of PLS-DA model scores for conventional chemical constituents and neutral aromatic substances in domestic and foreign wrapper tobacco leaves

2.3.1 关键性差异指标筛选本文基于常规化学成分和中性致香物质建立的PLS-DA模型拟合参数为R2Y=0.951,表明模型中两个预测主成分对Y变量变异的解释能力为95.1%;Q2=0.915,表明模型中两个预测主成分对不同烟叶样品的预测能力为91.5%,综合来看,模型拟合较好。国内外茄衣烟叶常规化学成分和中性致香物质PLS-DA模型得分分布和VIP表分别如图2和表3所示。由图2可知,PLS-DA模型成功区分了国内外茄衣烟叶样品,并得出影响茄衣烟叶的16种关键性差异指标(VIP>1.000)[23]。由表3可知,这些指标分别是二氢猕猴桃内酯含量、2-乙酰基吡咯含量、巨豆三烯酮2含量、β-大马酮含量、糠醛含量、巨豆三烯酮4含量、苯甲醛含量、3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮含量、2-乙酰基呋喃含量、愈创木酚含量、5-甲基糠醛含量、总氮质量分数、总糖质量分数、还原糖质量分数、烟碱质量分数和氮碱比。国内外茄衣烟叶常规化学成分和中性致香物质PLS-DA模型如图3所示,通过置换检验(n=200)评估模型是否过度拟合。由图3可知,Q2回归直线与Y轴的截距小于0(-0.314),表明该PLS-DA模型不存在过拟合现象[24],模型较为可靠。

表3 国内外茄衣烟叶常规化学成分和中性致香物质PLS-DA模型VIP表Table 3 VIP table of conventional chemical constituents and neutral aromatic substances PLS-DA model of wrapper tobacco leaves in domestic and foreign

图3 国内外茄衣烟叶常规化学成分和中性致香物质PLS-DA模型Fig.3 PLS-DA model for conventional chemical constituents and neutral aromatic substances in domestic and foreign wrapper tobacco leaves

2.3.2 关键性差异指标分析国内外茄衣烟叶常规化学成分和中性致香物质关键性差异指标热图分析如图4所示,其中颜色越接近绿色表示含量越高,越接近红色表示含量越低。由图4可知,国内茄衣烟叶β-大马酮、愈创木酚、巨豆三烯酮4、巨豆三烯酮2、2-乙酰基呋喃、5-甲基糠醛、糠醛、3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮含量相对较高,烟碱、还原糖和总糖质量分数相对较高;国外茄衣烟叶苯甲醛、2-乙酰基吡咯和二氢猕猴桃内酯含量相对较高,总氮质量分数、氮碱比较高。国内茄衣烟叶烟碱质量分数高于国外茄衣烟叶,这可能与我国雪茄烟叶产区植烟土壤本身肥力较高,又施以大量氮肥有关[25-26]。氮碱比作为评价烟叶感官品质的一个重要指标,数值过高会导致烟叶香气质较差、强度较弱、余味欠舒适[27-28]。国内茄衣烟叶氮碱比偏低,这主要是国内茄衣烟叶烟碱质量分数过高造成的[29]。因此,建议在当前茄衣烟叶种植过程中适当减氮增密,以降低烟碱质量分数进而提高茄衣烟叶品质。茄衣烟叶的糖含量可能与种植地区的纬度有密切关系,低纬度地区烟叶生长季温度较高、昼夜温差小,烟株生长较快、夜间呼吸消耗多;高纬度地区的日间光合资源较为充足、昼夜温差大,光合产物积累相对较多[30]。国内雪茄烟叶种植纬度与国外相比普遍较高,推测这是导致国内茄衣烟叶总糖、还原糖质量分数显著高于国外茄衣烟叶的直接原因。国内茄衣烟叶中,2-乙酰基呋喃含量相对较高,其会极大增加烟叶的抽吸杂气[31],这可能是导致国内茄衣烟叶杂气含量相对偏大的一个因素;糠醛含量也相对较高,其本身香味特征表现为甜香、面包香、黄油香[32],这与国内茄衣烟叶香味特征需求[33]相吻合,也是国内茄衣烟叶的一个普遍特色。

2.4 关键性差异指标相关性分析

国内外茄衣烟叶常规化学成分和中性致香物质关键性差异指标相关性分析如图5所示,其中,*代表显著相关,** 代表极显著相关。由图5可知,总氮质量分数与二氢猕猴桃内酯等11种关键性差异指标含量呈显著或极显著相关,除与二氢猕猴桃内酯、2-乙酰基吡咯和苯甲醛含量为极显著正相关外,与其他指标均为显著或极显著负相关。总糖和还原糖质量分数与巨豆三烯酮2、β-大马酮、糠醛、3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮、2-乙酰基呋喃和5-甲基糠醛含量呈显著或极显著正相关,与二氢猕猴桃内酯、2-乙酰基吡咯和苯甲醛含量呈极显著负相关。氮碱比与二氢猕猴桃内酯、2-乙酰基吡咯和苯甲醛含量呈极显著正相关,与巨豆三烯酮2含量等7种关键性差异指标呈显著或极显著负相关。烟碱质量分数与巨豆三烯酮2、β-大马酮、巨豆三烯酮4和愈创木酚含量呈显著或极显著正相关,与二氢猕猴桃内酯、2-乙酰基吡咯和苯甲醛含量呈极显著负相关。相关性分析结果表明,PLS-DA模型筛选出来的关键差异性指标中常规化学成分和中性致香物质密切相关,在烟叶中,不同中性致香物质的含量较少,不宜定向调控,但是常规化学成分含量较高,相对容易调控,因此可以通过调控烟叶常规化学成分含量,影响与之相关的中性致香物质含量。

图4 国内外茄衣烟叶常规化学成分和中性致香物质关键性差异指标热图分析Fig.4 Thermographic analysis of the key difference components of the conventional chemical constituents and neutral aromatic substances in domestic and foreign wrapper tobacco leaves

图5 国内外茄衣烟叶常规化学成分和中性致香物质关键性差异指标相关性分析Fig.5 Correlation analysis of key differences between conventional chemical constituents and neutral aromatic substances in wrapper tobacco leaves of domestic and foreign

3 结论

本文采用偏最小二乘判别分析法,对40份国内外茄衣烟叶样品的常规化学成分和中性致香物质进行对比分析,筛选出16种关键性差异指标,其含量分布规律为:国内茄衣烟叶烟碱、还原糖和总糖的质量分数,β-大马酮、愈创木酚、巨豆三烯酮4、巨豆三烯酮2、2-乙酰基呋喃、5-甲基糠醛、糠醛、3,4-二甲基-2,5-呋喃二酮的含量相对较高;国外茄衣烟叶总氮质量分数,氮碱比,苯甲醛、2-乙酰基吡咯和二氢猕猴桃内酯的含量较高。采用Pearson相关性分析法对这16种差异指标进行分析,结果表明,总氮质量分数和氮碱比与二氢猕猴桃内酯、2-乙酰基吡咯和苯甲醛的含量呈极显著(P<0.01)正相关,与巨豆三烯酮2、β-大马酮的含量呈显著(P<0.05)或极显著负相关,而总糖、还原糖和烟碱的质量分数与上述中性致香物质含量之间的关系则均相反。后续可以通过调控烟叶常规化学成分含量,影响与之相关的中性致香物质含量,以优化国内茄衣烟叶生产技术,改善烟叶香气,降低烟叶杂气,突出烟叶香韵特色和风味特征。