结构脂质的酶法合成及应用酶工程提高其合成效果的研究进展

赵泽鑫,周灵,韩美玲,许源,蔡俊

湖北工业大学 生物工程与食品学院/发酵工程教育部重点实验室/工业发酵湖北省协同创新中心/工业微生物湖北省重点实验室,湖北 武汉 430068

0 引言

结构脂质(Structured Lipids,SLs)是通过化学法或酶法重构天然油脂甘油骨架上脂肪酸组成和(或)分布而获得的具有特定分子结构的功能性油脂,除具有供能作用外,还具有抑制脂肪积累、降低血清胆固醇和血脂水平、提高免疫力等生理功能[1]。在烹饪或食品加工过程中,使用SLs代替传统膳食油脂既不会改变食品原有口感和风味,同时还能预防和改善因过量摄入油脂而引发的慢性疾病[2]。因此,SLs的推广使用符合“全面推进健康中国建设”重大决策部署的要求[3]。SLs天然存在于生物体中,但因其含量较低且难以与理化性质接近的油脂成分分离,故必须通过人工合成才能大量获得[4]。然而,人工合成SLs时需要对甘油酯骨架进行选择性修饰,导致无专一性的化学合成法难以满足高品质SLs产品制备的需求[5]。

酶法合成具有专一性强、催化效率高、环境友好等优势,符合绿色工业发展的趋势,更适合SLs这类具有特定化学结构的物质的制备[6]。脂肪酶(Lipase,EC 3.1.1.3)是一种存在于动植物和微生物中的生物催化剂,除在水相体系中具有脂解活性外,还能在非水相体系中催化酯合成、转酯化、醇解、酸解等反应,被广泛应用于油脂改性[7-9]。尽管已有研究[10]表明,天然脂肪酶能用于合成SLs,但其存在稳定性较差、活力较低、反应周期较长、与反应体系兼容性较差(底/产物抑制、pH适用范围窄、传质受阻)等问题,限制了其工业化应用。因此,通过酶工程技术强化酶分子的性能,提高其催化效率、稳定性、重复利用性等是推进酶法合成SLs工业化实践的关键。本文拟系统综述SLs的酶法合成及包括结构设计和固定化在内的酶工程技术在酶法合成SLs中的应用现状,以期为进一步拓展酶工程技术在SLs合成中的应用研究提供思路和参考。

1 SLs的酶法合成

目前,备受业界关注的SLs主要有人乳脂替代品(Human Milk Fat Substitutes,HMFS)、中-长-中(Medium-Long-Medium,MLM)型甘油三酯(Triacylglycerol,TAG)、甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)、结构磷脂(Structured Phospholipids,SPLs)等[11-12]。有研究[13]发现,只有对甘油骨架特定位置脂肪酸进行专一性修饰才能得到SLs,按照位置专一性可将脂肪酶分为无位置专一性脂肪酶和sn-1,3位置专一性脂肪酶,而sn-2位置专一性脂肪酶尚未被发现。因此,使用sn-1,3位置专一性脂肪酶对甘油酯进行修饰是目前最常用的SLs酶法合成途径之一[12]。

1.1 HMFS

HMFS是一种模拟人乳脂脂肪酸组成及其位置分布的TAG混合物,其主要结构特征为甘油骨架sn-2位结合的脂肪酸是饱和脂肪酸(如棕榈酸)而sn-1,3位结合的脂肪酸是不饱和脂肪酸(如油酸、亚油酸等),因具有促进脂肪酸吸收、缓解便秘等功效,已被用于婴幼儿配方奶粉及特医食品中[14-15]。目前,常用于合成HMFS的商品化sn-1,3位置专一性脂肪酶有Lipozyme RM IM、Lipozyme TL IM和Novozyme 435[16-19]。如肖乾煌等[20]研究发现,脂肪酶Lipozyme RM IM可催化酸解三棕榈酸甘油酯合成HMFS,且产物中sn-2位棕榈酸含量高达94.51%,sn-1,3位油酸含量约为70%。再如熊志琴等[21]采用两步法,即先利用脂肪酶Novozyme 435通过酸解反应制备sn-2位富含棕榈酸的TAG,再使用脂肪酶Lipozyme TL IM催化TAG与鱼油酯交换合成HMFS,目标产物的纯度可达95%,其中多不饱和脂肪酸含量为23%,而sn-2位棕榈酸的相对含量达66.92%。此外,通过基因挖掘得到来源于Aspergillusoryzae、Rhizomucormiehei、Candidaparapsilosis、猪胰脏等的脂肪酶也表现出较好的HFMS合成效果[22-24],其中来源于R.miehei的脂肪酶,在转化三棕榈酰甘油酯合成OPO结构脂时,产物sn-2位棕榈酸含量高达93%,极具应用前景[23]。

1.2 MLM型TAG

MLM型TAG的甘油骨架sn-1,3位置为中链脂肪酸(C6-C12),而sn-2位置为长链脂肪酸(C12-C24),热值低,具有控制肥胖、改善脂肪吸收不良及其他代谢紊乱等功能[25]。B.H.Jennings等[26]研究发现,辛酸-油酸-辛酸MLM型TAG可用于替代传统膳食油脂进行食物烹饪,且不影响食品原有口感和风味。MLM型TAG与HMFS的合成原理类似,也分为酸解法、酯化法和两步法。其中,酸解法因原料来源广泛且产物易与游离脂肪酸分离而应用较广,但该方法脂肪酸插入的准确率偏低[27-29]。H.B.Jadhav等[30]利用超声辐射辅助脂肪酶Novozyme 435催化亚麻籽油和葵酸酸解合成MLM型TAG的产率高达96%,与无辅助体系相比提升了4倍以上,为高效、精确合成MLM型TAG提供了思路。此外,两步法也能提高脂肪酸插入的准确率,如R.Morales-Medina等[31]先使用脂肪酶Novozyme 435催化甘油和辛酸酯化生成DAG,再在己烷的参与下,与从鱼油中提取的长链脂肪酸反应生成MLM型TAG,与一步酯化法相比,该方法使SLs合成准确率提升了72%。

1.3 DAG

DAG是由羟基替代TAG中的一个酰基所形成的,天然存在于植物油中,但含量非常低,且不易与TAG分离[32]。高纯度(>40%)的DAG具有降低血清胆固醇和血脂水平、控制体重增长、调节血糖等生理功能,是备受青睐的传统膳食油脂替代品[33-35]。DAG的酶法合成包括部分水解、甘油解、酯交换和酯化4种反应模式。其中,部分水解以TAG为底物,DAG的得率和纯度均较低,还需进一步分离纯化[36];酯交换以单甘酯(MAG)为底物,原料成本过高,不适合大规模生产[37];而甘油解合成的DAG纯度通常为50%～85%,工艺相对简单[38]。B.L.A.P.Devi等[34]在减压条件下使用脂肪酶Lipozyme RM IM催化葵花籽油和米糠油进行甘油解合成DAG的产率为84%。sn-1,3位置专一性脂肪酶能催化甘油和脂肪酸直接酯化合成DAG,产物(主要为1,3-DAG)得率达85%以上[39]。如X.Meng等[40]采用固定化脂肪酶M(Mucorjavanicuslipase)催化系列脂肪酸与甘油发生酯化反应,产物中DAG的纯度和产率均大于90%。由此可见,甘油解和酯化是较具潜力的高纯度DAG合成方式。

HMFS型TAG、MLM型TAG、sn-1,3 DAG等SLs都具有对称结构,其酶法合成过程中会伴随酰基转移,从而打乱甘油骨架上脂肪酸的位置分布。抑制酰基转移是进一步提高此类SLs精准合成的关键。T.Yang等[41]通过变动反应温度抑制三棕榈酸酸解反应过程中酰基转移的发生来减少副产物的生成,与恒温反应相比,该方法的酰基转移率降低了61%;I.H.Kim等[42]尝试在超临界CO2的环境中进行玉米油和辛酸的酸解反应来合成MLM型TAG,此方法使产物中β位辛酸从无溶剂体系中的18.0 mol%下降至9.4 mol%,有效减少了副产物的含量;N.J.Zhong等[43]在真空驱动空气/氮气鼓泡反应器中进行脂肪酸与甘油的酯化反应来合成1,3-DAG,该体系能提高传质并加快水分去除速度,有效抑制酰基转移,推动反应向酯化方向进行,提高产物得率。此外,超声波辅助反应可增强传质,提高底物与脂肪酶接触的几率,从而加强催化效果,缩短反应时间,在提高反应效率的同时减少酰基转移发生,最终提高SLs产率[30,44-45]。因此,分段变温反应、超临界流体反应、真空反应、超声波辅助等都能通过抑制酰基转移来提高此类SLs的酶法合成效果。

使用sn-1,3位置专一性脂肪酶合成上述SLs,一般需要对甘油骨架外侧两个位置进行修饰才能得到目标产物,在这个过程中容易积累单一位置修饰的副产物,从而导致产物纯度不高。如能筛选挖掘获得高活性β位置专一性脂肪酶,则可对TAG甘油骨架唯一的sn-2位置进行专一性修饰,减少反应步骤,有效缓解副产物积累,高效、准确地生成TAG型SLs。

1.4 SPLs

磷酸甘油酯是细胞膜的主要组成成分,其结构以3-磷酸甘油为骨架,其中sn-1,2位置连接脂肪酸,而磷酸基团与其他小分子酯化相连。SPLs是通过修饰天然磷脂甘油骨架上sn-1,2位的脂肪酸或与磷酸基团连接的酰基获得的,包括磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰醇胺、磷脂酰甘油等,具有调节机体新陈代谢和辅助机体修复生物膜损伤的功效[46-47],其作为乳化剂、稳定剂和抗氧化剂已被广泛应用于食品、制药、化妆品等行业[46]。因涉及与磷酸连接基团的置换,SPLs的酶法合成除了能使用对甘油骨架sn-1,2位进行修饰的脂肪酶和磷脂酶B外,还可使用磷脂酶C和D[48-51]。M.Okulus等[52]利用脂肪酶Novozyme 435催化磷脂酰胆碱和3-甲氧基肉桂酸进行酯交换合成SPLs,产率可达48%;张芹等[53]和廖妙飞等[54]以卵磷脂为底物、磷脂酶D为催化剂,合成了磷脂酰丝氨酸,产物得率均超过85%。目前,有关利用磷脂酶B合成SPLs的研究较少,其主要原因是大多数磷脂酶B的结构信息和催化机制尚不清楚,阻碍了磷脂酶B在SPLs生产中的应用[55]。而磷脂酶C介导的反应易形成甘油酯副产物,因此也不适合SPLs的合成[47]。

1.5 其他SLs

除上述SLs外,MAG、酚类结构脂、糖酯、神经酰胺酯、类可可脂、长-中-长(Long-Medium-Long,LML)型TAG等也可通过酶法合成[40]。Z.X.Huang等[56]以棕榈中间馏分和硬脂酸共混物为底物,使用脂肪酶Lipozyme RM IM发生酯交换反应合成类可可脂,产品中脂肪酸的组成与天然可可脂一致,产率超过92%;W.S.Lian等[57]采用Thermomyceslanuginosus脂肪酶固定化形式催化三辛酸甘油酯和亚油酸乙酯的转酯化反应合成LML型TAG,产物中中长链结构脂含量达85.24 mol%,其中LML型TAG占97.00 mol%。随着研究的不断深入,功能性SLs的种类还会继续增加,只有不断丰富生物酶工具,完善相应的合成工艺,才能满足各类SLs精准合成的需求。

2 脂肪酶结构设计对SLs合成效果的影响

脂肪酶的生化性质对其催化SLs合成具有重要影响,通过结构设计可强化脂肪酶的性能,提升酶法合成SLs的效果。J.H.Zhang等[58]设计了R.miehei脂肪酶的突变体Asp256Ile/His257Leu,其酯化活力提高了2.37倍,催化三棕榈酸甘油酯及棕榈油与油酸酯交换的速率分别提高了1.82倍和1.65倍;L.L.Li等[59]对Malasseziaglobose脂肪酶进行定点突变,构建了含有5个突变位点和1个额外二硫键的突变体,其热稳定性显著提高,催化油酸和甘油进行酯化反应合成DAG,产率提高了9.1%;J.M.Woo等[60]设计了C.antarctica脂肪酶B的突变体A282E/I285F,其对正壬酸的选择性提高了2倍,更有利于合成含中链1-MAG。截至2023年8月,已有4712个脂肪酶晶体结构被解析,其空间结构(具有α/β水解酶折叠形式,多数分为催化核心区和盖子区)和催化元件(空间上高度保守的Ser-His-Asp催化三联体和氧负离子洞)的特征也得到了揭示[61],这为其结构与功能关系的解析及基于结构信息的设计打下了坚实的基础。

2.1 催化效率

提升脂肪酶催化效率的策略主要有以下3种:1)增强脂肪酶与底物间的相互作用;2)降低反应的活化能;3)加快反应产物的释放。如在Bacillusthermocatenulatus脂肪酶的盖子区域,利用疏水残基取代亲水残基得到的突变体Y225F/S232A与底物间的疏水相互作用增强,其活性增强了约35%[62]。因此,根据底物结合构象对脂肪酶结构进行设计,可进一步强化底物与脂肪酶的相互作用,提高脂肪酶活力。通过设计脂肪酶活性中心附近残基来调节酶与底物活性基团的距离,可起到调控反应活化能的作用,进而影响反应效率。Pyrobaculumcalidifontis脂肪酶在催化过水解反应时,底物H2O2会与Y21和H144形成氢键,若分别将Y21和H144突变为无极性但位阻接近的苯丙氨酸和色氨酸后,底物H2O2与脂肪酶的联系减弱,亲核进攻酰酶复合物中间产物的距离变长,反应能垒提高,催化效率大幅降低[63]。Geobacillussp.12AMOR1甘油单酯脂肪酶催化单月桂酸酯水解时,产物脂肪酸与其释放路径中的L128、L142等多个残基存在疏水相互作用,阻碍了其从催化活性中心释放,而作用力减弱的突变体L128A和L142A的活力显著提高[64],这表明加速底物的释放也能有效提高脂肪酶的催化效率。此外,脂肪酶催化活性区的构象稳定性、界面吸附能力等因素也可影响脂肪酶的催化活性[62,65],对这些因素的调控也是提高脂肪酶活性的可行思路。

2.2 稳定性

在反应过程中,脂肪酶因空间结构发生变性而失活。通过增加脂肪酶内部的相互作用,稳定柔性较大的局部结构(主要分布在N末端、C末端、盖子等区域),在热力学上提高蛋白质变性的难度,是增强脂肪酶稳定性的主要策略。在脂肪酶中引入具有较高键能的共价键能有效提高其结构稳定性。如通过蛋白质结构分析、晶体结构B因子分析、分子模拟等方法确定脂肪酶柔性较大的局部结构,以定点突变的方式引入二硫键,可使脂肪酶的稳定性大幅提升[66-70]。此外,增强高柔性区域之内或之间残基的非共价键(如氢键、盐桥、π-π堆积相互作用等)也能有效增强脂肪酶的稳定性。如在Yarrowialipolytica脂肪酶Lip2中,利用脯氨酸替换位于高柔性区G207—K221的V213,通过形成更多的分子内氢键稳定蛋白质的整体构象,使突变体V213P比野生型在50 ℃下的半衰期延长了约70%[71];在Stenotrophomonasmaltophilia脂肪酶高灵活区域,以在G165与F36之间引入盐桥的方式模拟氢键网络,所构建突变体G165 D/F36R的最适温度从35 ℃增加至90 ℃[72];在G.stearothermophilus脂肪酶T6的L350与H359之间引入π-π堆积相互作用,所得突变体L360F的稳定性为野生型的81.2倍[73]。

2.3 底物专一性

2.3.1 脂肪酸专一性对于具有特定脂肪酸组成的SLs,与脂肪酶相适应的脂肪酸专一性是决定SLs能否精准合成的关键因素之一。目前,脂肪酶中脂肪酸专一性的强化主要是通过重塑底物口袋几何外形以适配底物的结合构象来实现,如C.antarctica脂肪酶A(CALA)的突变体T221 H、I301 H等,可使其酰基结合通道的某一区域变狭窄,只能让构象笔直的反式脂肪酸和饱和脂肪酸进入,而形态弯折的顺式脂肪酸不能进入,从而使CALA对部分氢化植物油中的反式脂肪酸和饱和脂肪酸的专一性显著提升[74];而将BurkholderiacepaciaKWI-56脂肪酶酰基结合通道入口扩宽的突变体F119A/L167 M,可提高其对长链底物的专一性[75]。此外,增强脂肪酶与底物之间的相互作用,从而提高底物结合的稳定性,也可实现脂肪酸专一性的改造。C.C.Yen等[76]对C.rugosaLIP2底物结合位点上的残基G450进行特异性饱和诱变,所得突变体G450A与底物之间的疏水相互作用得到增强,对短链甘油三酯的催化活性比野生型增强了5倍;在CALA酰基结合通道末端设计突变体G237 L/V/Y,缩短通道的长度,可提高脂肪酶结合长链脂肪酸的难度,并使其对中链脂肪酸的催化活性增强[77]。由此可见,依据底物结合模式,在脂肪酶底物结合口袋构建突变体,是强化其对脂肪酸专一性的有效策略。

2.3.2 位置专一性脂肪酶的位置专一性是决定SLs精准合成的另一关键因素。因尚未获得sn-2位置专一性脂肪酶,目前SLs的合成主要是通过sn-1,3位置专一性酶对天然油脂sn-1,3位脂肪酸进行修饰来实现的[78]。脂肪酶的位置专一性可通过结构设计来调控。Z.X.Zhao等[79]通过晶体结构解析、分子建模和诱变实验构建了Streptomycessp.W007脂肪酶MAS1的突变体G40E、N45Y、H108W、T237Y等,这些突变体底物结合口袋中TAG非活性羰基结合位点的空间位阻均有所增加,促使非特异性MAS1转变为sn-1,3位置专一性脂肪酶。Y.Z.Cai等[80]对Penicilliumexpansum脂肪酶的C末端无序结构进行同源替换和定点突变,所构建的突变体loopAO和M234F使底物结合口袋中的结合空间显著缩小,使得催化三辛酸甘油酯水解的产物中1,2-二辛酸甘油酯和1,3-二辛酸甘油酯的物质的量比值从1.01分别增加至25.57和8.57,表现出明显的sn-1,3位置专一性。这些研究成果为脂肪酶位置专一性的调控提供了坚实的理论基础,但探索sn-2位置专一性脂肪酶的调控策略依然是该领域的重大挑战。

3 脂肪酶固定化对SLs合成效果的影响

在SLs的酶法合成中,游离脂肪酶易变性失活且不易回收,致使酶法合成SLs成本高昂。固定化是指通过特定的物理或化学方法将脂肪酶限制于特定区域内的方法,可提高脂肪酶的活性和稳定性,有效增强其可重复利用性,降低成本[81-83]。目前,脂肪酶的固定化方法主要包括物理吸附、包埋、共价结合和交联这4种基本方法。

3.1 物理吸附固定化

物理吸附固定化是指通过氢键、离子键、疏水作用力、范德华力等非共价相互作用将脂肪酶与载体进行结合的方法[84-85]。目前,固定脂肪酶的载体有极性/非极性吸附树脂、硅藻土等材料,且此类固定化脂肪酶(如树脂NKA-9吸附脂肪酶CALA、树脂Amberlite XAD1180吸附脂肪酶MAS1-H108A和硅藻土吸附R.oryzae脂肪酶)已成功应用于DAG(产率64.37%)、富含n-3 PUFA的TAG(甘油解反应和酯化反应产物的产率分别达到92.07%和76.13%)、MLM型TAG(sn-2位插入率高达41.53%)等SLs的合成[86-88]。但由于脂肪酶与载体的相互作用力较弱,导致物理吸附固定化中的催化过程易发生解吸附[89]。在已有研究[86,90]中,物理吸附固定的脂肪酶经历10次循环利用后,难以保持50%以上的初始酶活力。基于此,物理吸附与包埋联用法被提出,该方法利用包埋材料对脂肪酶的固定作用进一步加强载体对脂肪酶的固定能力。X.Y.Cai等[91]将C.antarctic脂肪酶B(CALB)包埋在沸石咪唑骨架上,通过物理吸附与大孔树脂键合,所得固定化酶重复利用10次后仍保留了84.2%的初始酶活力。物理吸附的载体成本低、固定工艺简单、条件温和,与包埋联用可有效增强载体对脂肪酶的固定能力,降低解吸附发生的概率。

3.2 包埋固定化

包埋固定化是将脂肪酶限制在载体材料所形成的网格中,从而实现固定脂肪酶的方法,该方法对脂肪酶的天然结构基本无影响[92]。E.Akil等[93]使用壳聚糖-海藻酸盐珠包埋Yarrowialipolytica脂肪酶,固定化效率达96.8%,可用于催化MLM型TAG的合成。包埋对脂肪酶的固定化效率较高,但过小的网格孔径会影响底物与脂肪酶的接触,影响催化效率。W.Y.Chen等[94]将CALB包埋在鸟嘌呤核苷酸和金属离子构建的配位中,但由于底物传质受阻,在催化甘油解反应时表现出较低的酶活力。通过调节网格孔径降低传质阻力是提升包埋固定的脂肪酶催化效率的有效方法,M.M.Li等[95]采用2,5-二(丁烯氧基)对苯二甲酰肼制备共价有机骨架,并用于包埋过氧化氢酶,发现优化网格孔径可有效改善传质能力,提高固定化脂肪酶的催化效率。

3.3 共价结合固定化

共价结合是指通过载体材料表面官能团(如氨基、羧基、羟基、羟甲基等)与脂肪酶基团(如赖氨酸的ε-氨基、半胱氨酸的硫醇基团、天冬氨酸和谷氨酸的羧基等)形成的共价键将脂肪酶固定于载体上的方法[96-98]。由于共价键的键能较强,共价结合固定的脂肪酶不易脱落,有利于重复利用过程中脂肪酶的保留[98]。X.X.Li等[99]在催化甘油和油酸的酯化反应研究中发现,与游离酶相比,使用树脂ECR8285共价结合Malasseziaglobosa脂肪酶表现出更好的热稳定性和更高的酯化率(DAG和MAG产率均为79%),固定化酶经历6次循环重复利用后,仍可保持99%的初始酶活力。但共价结合的反应条件剧烈,易导致脂肪酶蛋白的高级结构发生变化,从而使脂肪酶活性发生变化,反应效率降低[100]。T.Bavaro等[101]研究发现,分别使用EC-HFA和EC-EP(产自Resindion Srl公司)共价结合Pseudomonascepacian脂肪酶,酶活回收率分别约为7.1%和1.9%。在固定脂肪酶时,通过界面活化的方式将脂肪酶的盖子结构打开,以此共价结合固定的脂肪酶其活力更高。J.F.Zhao等[102]使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷和戊二醛对纳米Fe3O4进行改性,并以蔗糖酯-11为表面活性剂进行界面活化,将R.oryzae脂肪酶固定在载体上,在该固定化脂肪酶催化的酯化反应中,1, 3-DAG的产率达到76%,酯化活性约为游离脂肪酶的1.5倍。

3.4 交联固定化

交联固定化(也称为无载体交联)是指以双官能或多官能化合物为交联剂交联脂肪酶,建立稳定的化学键,从而形成稳定性较强的无载体大颗粒脂肪酶的方法[97]。但酶分子的堆叠导致被包埋部分难以与底物接触,固定化的酶活性回收率较低[97]。因此,该方法一般作为其他脂肪酶固定化方法的辅助手段,以进一步提高固定化酶的稳定性。W.L.Xie等[103]采用交联-共价固定法,以戊二醛为交联剂交联C.rugosa脂肪酶,随后共价结合于3-氨基丙基功能化的磁性核壳纳米复合材料上以合成固定化脂肪酶,并用其催化以猪油和大豆油混合物为底物的酯化反应,产物中不同种类TAG的含量均发生变化,循环利用4次后,催化活性没有明显损失,可重复利用性明显优于未交联固定化酶。

4 结论与展望

本文梳理了酶法合成SLs技术的研究进展,综述了各类SLs的酶法合成方法,以及如何通过酶工程技术提升产物得率,指出了脂肪酶催化活性、稳定性和底物专一性是决定SLs酶法合成效果的关键因素,通过对脂肪酶结构的设计可实现上述性能的提高,增强SLs的合成效率和精准性,同时脂肪酶的固定化也能提升其稳定性和可重复利用性,有效降低SLs酶法合成的成本。在酶促反应过程中,自发的酰基转移作用是SLs产率进一步提高的重要原因,通过分段变温反应、超临界流体反应、真空反应、超声波辅助等途径可抑制酰基转移,在SLs酶法合成中具有较大的应用潜力。对于结构磷脂,除脂肪酶外,还可使用磷脂酶B、C和D对天然磷脂进行修饰合成SLs。只有不断丰富生物酶工具,完善相应的合成工艺,才能满足更多类型SLs的酶法合成需要。脂肪酶的结构设计是创制高性能SLs合成使用酶制剂的基础,增强脂肪酶与底物间的相互作用、降低反应的活化能及加快反应产物的释放是提高脂肪酶反应活性的常用策略,而增加脂肪酶内部的相互作用、稳定柔性较大的局部结构及在热力学上提高蛋白质的变性难度,则可用于脂肪酶稳定性的提升,重塑脂肪酶底物的结合口袋,使其更适应于特定SLs合成的需要,这也是脂肪酶设计领域关注的重点。脂肪酶的固定化包括物理吸附、包埋、共价结合和交联4种方法,选择合适的固定化载体和方法可有效延长脂肪酶的使用周期,增强其可重复利用性。未来SLs酶法合成领域将聚焦高活性、鲁棒性和底物专一性酶制剂的创制,完善SLs酶法合成反应体系,开发相应的工业化生产设备,以期为SLs酶法合成技术和工艺的发展提供研究基础。