基于抗氧化活性筛选旋覆花提取工艺及干燥技术的研究 *

胡晓莲 盛芳玲 黄学娣 唐莉华

（江西省中西医结合医院药剂科，江西 南昌 330003）

旋覆花为菊科植物旋覆花或欧亚旋覆花干燥的头状花序，别名有“金沸草”“六月菊”等，具有降气化痰、止呕等功效［1-3］，为2020 版《中华人民共和国药典》收载之品种，临床常用于治疗肋下胀满、祛湿、下行疏气。现今报道［4-8］，旋覆花含有丰富的倍半萜类及内酯类、黄酮类、有机酸类成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等诸多药理作用［9-14］，并广泛运用于经典复方和现代中药制剂中。同时，关于旋覆花，有“诸花皆升，唯我独降”的说法，对肺部疾病的治疗具有特殊的考究意义。至今，对于旋覆花的功效成分的提取报道不多［14-16］，而中药有效成分的提取是决定中药药效的关键因素。现今常利用现代科学的统计思维优化中药的提取工艺，这对中药有效成分的溶出和中药资源合理的利用具有显著的指导意义。本研究中，采用单因素结合效应面法（Box-Behnken）设计优化筛选旋覆花的提取工艺，并对优化后制备的提取物进行不同干燥方式的考察，以DPPH自由基清除率为评价依据，筛选出最优干燥方式，以期为未来开发以旋覆花为主的抗氧化产品提供合理的生产工艺依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器日本岛津LC-20AT 高效液相色谱仪系列，JY10002 电子天平［聚仪惠供应链（青岛）有限公司］；电热恒温干燥箱（沧州极光试验仪器有限公司）；远红外干燥箱（上海昕仪仪器仪表有限公司）；真空冷冻干燥箱（常州市孝昌干燥设备有限公司）；KQ250DB 型数控超声波清洗器（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.2 材料对照品麝香草酚（批号：100508-201603），均购自中国食品药品检定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（批号：202109，规格为250 mg），购于武汉卡诺斯科技有限公司；色谱级甲醇（Fisher 公司），其余试剂分析纯。旋覆花5 kg，购自江西樟树药材市场，经唐莉华鉴定为旋覆花正品。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备取旋覆花粉末（过四号筛）0.5 g，精密称定，置25 mL 容量瓶中，加75%乙醇溶解并稀释至刻度，称重，超声30 min，冷却，称重，以75%乙醇补足失重，滤过，即得。

2.2 对照品溶液制备精密称取麝香草酚适量，制备成每1 mL含0.4006 mg的溶液，备用。

2.3 色谱条件月旭C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），甲醇-水（70∶30）；柱温30 ℃，流速：1.0 mL/min，波长275 nm。系统适应性高效液相色谱图见图1。

图1 旋覆花溶液系统适应性高效液相色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系精密吸取对照品溶液，按不同体积进行稀释，以峰面积（Y）为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程Y＝2015422.1691X-53956.81426，r=0.9994，麝香草酚在4.0006～40006 μg/mL间进样量与峰面积呈良好线性关系。

2.4.2 精密度实验精密吸取对照品10 μL，连续进样6次，记录麝香草酚峰面积，其相对标准偏差（RSD）为0.61%，说明该方法精密度良好。

2.4.3 稳定性实验同一供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，记录麝香草酚峰面积，其RSD为0.34%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性实验取同一样品，制备供试品溶液6份，分别进样，记录麝香草酚峰面积，麝香草酚的平均含量为0.6589 mg/g，RSD为1.42%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率取供试品粉末，按100%量进行加样，制备样品，记录麝香草酚峰面积，麝香草酚的回收率为100.98%，RSD为0.52%，表明方法的准确度良好。

2.5 旋覆花提取工艺单因素考察

2.5.1 单因素实验参考相关文献［7］的方法，在基础条件为回流30 min，料液比1∶30，提取1 次的情况下，保持其他因素不变，只改变其中1 个因素，设置料液比=1∶10、1∶20、1∶30、1∶40及1∶50；提取时间15 min、30 min、45 min、60 min 及90 min；提取次数为1 次、2 次、3 次；以麝香草酚含量和浸膏得率为考察指标，对单因素进行考察，结果见图2。

图2 旋覆花溶液单因素考察结果

2.5.2 响应面实验设计根据单因素的结果，在此基础上以不同料液比（A，包括1∶15、1∶30、1∶45）、不同提取时间（B，包括20 min、30 min、40 min）及不同提取次数（C，包括1 次、2 次、3 次）等3 个变量进行Box-Behnken 设计，以麝香草酚含量和浸膏得率为评价指标，采用R 语言设计编程三因素三水平共17 个实验点、12个析因点和5个零点，收集数据见表1。

表1 旋覆花提取工艺Box-Behnken实验设计结果

由表1 数据进行统计分析，所得均P＞0.05，相关系数R2=0.7387，模型可基本描述实验数据。由输出数据得二次回归方程为Y=19.45+0.14x1-0.36x2+0.80x3+0.05x1x2+0.04x1x3-0.46x2x3+1.23x12-0.11x22+0.09x32，方程中各项系数绝对值大小直接反应各因素对指标值的影响程度，系数的正负反映其影响方向。各因素对旋覆花提取影响的次数为C＞B＞A，即提取次数＞提取时间＞料液比。其方差分析结果中失拟项（Lack of fit）P=0.7811＞0.05，说明该方程对实验结果拟合良好。根据驻点信息输出可知，因素最佳水平为A=29.0965、B=41.8533、C=0.6152。按筛选最佳工艺料液比1∶30，提取时间40 min，提取1次进行3 次重复实验，平均麝香草酚含量为0.29%，浸膏得率为18.21%，结果符合预测。

2.6 提取物不同干燥方式及抗氧化活性评价选择的干燥方式有自然干燥、热风干燥、远红外干燥、微波真空干燥及真空冷冻干燥。各干燥方式的参数为（1）自然干燥：在25～35 ℃通风环境中自然晾干，每隔8 h 翻动一下，当水分低于10%时，即可停止；（2）热风干燥：置于60 ℃恒温烘箱中，每隔2 h翻动一下，风速为3 m/s，当水分低于10%时，即可停止；（3）远红外干燥：置于60 ℃的远红外烘箱（功率为2 kW）中，辐射距离200 mm，每隔1 h 翻动一下，当水分低于10%时，即可停止；（4）微波真空干燥：置于40 ℃微波真空干燥箱中，采用间歇式辐照方式即微波5 min，停止8 min，往复循环，每隔30 min翻动一下，当水分低于10%时，即可停止；（5）真空冷冻干燥：置于-40 ℃真空冷冻干燥箱中预冻6 h，而后将真空度调至70 Pa，当水分低于10%时，即可停止。抗氧化活性评价以DPPH 自由基清除能力强弱为评价依据，按测试试剂盒方法测定，结果见图3。从图中可知新鲜的旋覆花提取液的DPPH 自由基清除率达到73.5%，通过5 种干燥方式处理之后，清除率都有所下降，能力由低到高依次为自然干燥、热风干燥、远红外干燥、微波真空干燥及真空冷冻干燥。

图3 不同干燥方式对DPPH自由基清除率的影响

3 讨论

本研究在单因素的基础上，从料液比、提取时间、提取次数3 个主要因素考察了提取工艺，采用R 语言编程Box-Behnken 实验，并对程序数据进行分析处理，相比软件分析（SPSS、Design Expert）更加精密；经分析筛选，得出最佳的提取工艺，即料液比1∶30，提取时间40 min，提取1次。并且将该工艺重复进行3次，所得麝香草酚含量和浸膏得率与预测值相符合，表明该工艺稳定。

其次，对提取物的干燥方式进行考察，以DPPH 自由基清除率的大小来评断干燥方式的优劣，从图3 数据可知：真空冷冻干燥处理后的DPPH 自由基清除率最高；自然干燥相对时间漫长，因此难以保证有效成分不被氧化，继而抗氧化的能力降低；热风所采取的是高温干燥，某些受热不稳定的酚酸类成分结构已被氧化，从而导致整体的抗氧化能力降低；远红外是以光照进行干燥的方式，光分解作用也是影响抗氧化能力的一种，因此结果表现出较弱的抗氧化能力；微波干燥在于波长产生的热能对成分有一定的影响；而真空冷冻干燥有着低温、避光的特点，能尽可能地保护抗氧化成分不被破坏。

综上所述，对旋覆花提取工艺进行优化，并以抗氧化活性评价提取物的干燥方式，对制备旋覆花中间体及开发相关抗氧化产品都具有科学的指导意义。