茯神裂环羊毛甾烷型化学成分研究

邓子怡，郁阳，4，李莉，杨财子，孙云鹏，4，王国凯，3，4，刘劲松，4*（.安徽中医药大学药学院，合肥 300；.安徽中医药大学中西医结合学院，合肥 300；3.中药研究与开发安徽省重点实验室，合肥 300；4.中药功效物质组分校级重点实验室，合肥 300）

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Show.）Wolf的干燥菌核，是一种寄生在松树根部的好气性、喜干燥的腐生真菌[1-2]。茯神（Poria cum Pini Radix）为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Show.）Wolf菌核中抱有松根（即茯神木）的白色部分。茯神与茯苓虽均来源于茯苓菌核，但两者功效却有显著差别。茯苓味甘淡，性平，具有利水渗湿、健脾等功效；茯神味甘淡，性平，具有安神宁心、利水等功效，多用于治疗惊悸失眠、健忘、惊痫、小便不利等症[3]。茯苓和茯神均具有较好的生物活性[4]，但茯神以宁心、安神见长，两者的化学成分和含量差异可能是导致其功效不同的因素之一[5]。三萜类成分是茯神主要活性成分之一，大多以四环三萜的结构呈现[6]，主要分为羊毛甾烷三萜烯型和3，4-裂环-羊毛甾烷三萜烯型两种类型[7]。为进一步探究茯神的化学成分，寻找其安神宁心的药效物质基础，本课题组利用中药化学分离手段和现代波谱学鉴定技术对茯神化学成分进行研究，从中分离鉴定出11个裂环羊毛甾烷型单体化合物，分别为茯苓新酸B（1）、茯苓新酸A（2）、茯苓新酸DM（3）、16α，27-二羟基-3，4-裂环羊毛甾-4（28），8（9），24-三烯-3，21-二酸（4）、茯苓新酸ZC（5）、茯苓新酸ZM（6）、茯苓新酸E（7）、茯苓新酸D（8）、茯苓新酸ZG（9）、茯苓新酸M（10）、茯苓新酸L（11），结构式见图1。

图1 化合物1～11的化学结构Fig 1 Chemical structures of compounds 1～11

1 材料

1.1 仪器

Bruker AVⅢ-600（德国Bruker公司）；Agilent 1100分析型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Waters AutoSpec Premier P776质谱仪、Waters 1525半制备型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Agilent 5 HC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）分析柱；Waters Sunfire（250 mm×19 mm，5 μm）制备柱。

1.2 试药

200～300目（50～71 μm）柱色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司）；45 mm Lichroprep RP-18反相柱色谱硅胶（日本Fuju Silysia化工有限公司）；Sephadex LH-20凝胶（美国CE公司）；色谱用甲醇、乙腈（英国欧普森公司）；氘代吡啶（美国Cambridge Isotope Laboratories公司）；其他试剂均为分析纯。

样品于2022年6月采集于安徽省金寨县桃岭乡，由安徽中医药大学彭华胜教授鉴定其基原为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Show.）Wolf，为菌核中间抱有松根的白色部分。鉴定标本（LA20221001）存于安徽中医药大学中药与天然药物化学教研室。

2 提取与分离

取茯神干燥药材55 kg，粉碎至20目，用3倍量100%甲醇室温下冷浸6次，每次24 h。合并提取液，减压浓缩至无甲醇味，得浸膏800 g。再经硅胶色谱柱二氯甲烷-甲醇（100∶0 ～0∶100）系统梯度洗脱，通过薄层色谱法（TLC）检识，合并相似流分，得到9个流分段（A1 ～A9）。

流分段A8（4.5 g）经ODS RP-18柱（甲醇-水，20∶10 ～100∶1）梯度洗脱，得到33个亚流分，即A8-1 ～A8-33。流分A8-33经Sephadex LH-20凝胶柱（甲醇）分离，得到8个流分，即A8-33-1～A8-33-8；A8-33-8经半制备型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，65∶35 ～80∶20）分离纯化得化合物1（12.57 mg，7.3 min）和化合物2（7.65 mg，8.8 min）。流分A8-32经Sephadex LH-20凝胶柱（甲醇）分离，得到5个流分，即A8-32-1～A8-32-5；A8-32-3经半制备型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，55∶45 ～70∶30，10.2 min）分离纯化得化合物3（5.82 mg）。A8-32-5经半制备型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，55∶45 ～70 ∶30，6.6 min）分离纯化得化合物4（9.44 mg）。流分A8-31经Sephadex LH-20凝胶柱（甲醇）分离，得到6个流分，即A8-31-1～A8-31-6；A8-31-6经半制备型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，50∶50 ～65∶35）分离纯化得化合物5（3.63 mg，7.1 min）和化合物6（4 mg，7.5 min）。流分A8-30经Sephadex LH-20凝胶柱（甲醇）分离，得到6个流分，即A8-30-1 ～A8-30-6；A8-30-5经半制备型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，50∶50 ～65∶35）分离纯化得化合物7（33.5 mg，7.0 min）和化合物8（9.6 mg，7.6 min）。A8-30-3经半制备型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，50∶50 ～65∶35，6.6 min）分离纯化得化合物9（13.22 mg）。

流分段A7（6.3 g）经ODS RP-18柱（甲醇-水，20∶10 ～100∶1）梯度洗脱，得到31个亚流分，即A7-1 ～A7-31。流分A7-26经Sephadex LH-20凝胶柱（甲醇）分离，得到6个流分，即A7-26-1～A7-26-6；A7-26-3经半制备型HPLC（乙腈-0.01%甲酸水，40∶60 ～55∶45）分离纯化得化合物10（14.1 mg，8.7 min）和化合物11（7.4 mg，9.8 min）。

3 结构解析

化合物1：黄色粉末。分子式C30H44O5。ESI-MSm/z：483 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.32 （d，J＝6.2 Hz，1H，H-11），5.27 （d，J＝4.0 Hz，1H，H-7），4.81 （d，J＝2.6 Hz，1H，H-28a），4.74 （1H，s，H-28b），4.50 （t，J＝7.2 Hz，1H，H-16），2.91 （d，J＝11.9 Hz，1H，H-20），2.83（dd，J＝11.2，5.9 Hz，1H，H-17），2.33 （t，J＝8.2 Hz，1H，H-5），1.71 （s，3H，H-29），1.59 （s，3H，H-26），1.57 （s，3H，H-27），1.47 （s，3H，H-30），1.07 （s，3H，H-18），1.01 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）数据见表1。以上波谱数据与文献[8]报道基本一致，故鉴定化合物1为茯苓新酸B。

表1 化合物1～6的13C-NMR数据 (150 MHz，C5D5N)Tab 1 13C-NMR data for compounds 1～6 (150 MHz，C5D5N)

化合物2：白色无定形粉末。分子式C31H46O5。ESI-MSm/z：497 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.32 （d，J＝4.9 Hz，1H，H-11），5.27（s，1H，H-7），4.96 （s，1H，H-31a），4.83 （s，1H，H-31b），4.81 （s，1H，H-28a），4.75 （s，1H，H-28b），4.49 （q，J＝12.3，9.8 Hz，1H，H-16），2.93 （td，J＝11.3 Hz，1H，H-16），2.84 （t，J＝8.7 Hz，1H，H-17），2.32 （d，J＝7.6 Hz，1H，H-5），2.26 （t，J＝7.2 Hz，1H，H-25），1.72 （s，3H，H-29），1.47 （s，3H，H-30），1.08 （s，3H，H-18），1.01 （s，3H，H-19），0.97 （d，J＝3.9 Hz，3H，H-27），0.96 （d，J＝3.9 Hz，3H，H-26）。13C-NMR（150 MHz，C5D5N）数据见表1。以上波谱数据与文献[9]报道基本一致，故鉴定化合物2为茯苓新酸A。

化合物3：白色无定形粉末。分子式C32H48O6。ESI-MSm/z：527 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.49 （s，1H，H-31a），5.29 （s，1H，H-11），5.27 （d，J＝3.9 Hz，1H，H-31b），5.17（s，1H，H-7），4.81 （d，J＝2.5 Hz，1H，H-28a），4.76 （m，1H，H-28b），4.54 （t，J＝7.2 Hz，1H，H-16），3.62 （s，3H，H-OMe），3.01 （s，1H，H-20），2.89 （dd，J＝11.2，5.9 Hz，1H，H-17），2.27 （d，J＝7.5 Hz，1H，H-5），1.71 （s，3H，H-29），1.55 （s，3H，H-26），1.55 （s，3H，H-27），1.43 （s，3H，H-30），1.07 （s，3H，H-18），0.96 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）数据见表1。以上波谱数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定化合物3为茯苓新酸DM。

化合物4：白色无定形粉末。分子式C30H46O6。ESI-MSm/z：501 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.49 （t，J＝6.9 Hz，1H，H-24），5.00（s，1H，H-28a），4.90 （s，1H，H-28b），4.53 （d，J＝12.2 Hz，1H，H-27a），4.48 （d，J＝7.3 Hz，1H，H-16），4.44 （d，J＝12.2 Hz，1H，H-27b），2.93 （t，J＝11.2 Hz，1H，H-20），2.79 （dd，J＝11.2，5.8 Hz，1H，H-17），2.32 （d，J＝12.9 Hz，1H，H-5），1.97 （s，3H，H-26），1.80 （s，3H，H-29），1.50 （s，3H，H-30），1.14 （s，3H，H-18），0.96 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）数据见表1。以上波谱数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定化合物4为16α，27-二羟基-3，4-裂环羊毛甾-4（28），8（9），24-三烯-3，21-二酸。

化合物5：白色无定形粉末。分子式C30H44O6。ESI-MSm/z：499 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.87 （d，J＝7.4 Hz，1H，H-28a），5.34（s，H，H-24），5.33 （s，H，H-11），5.28 （s，1H，H-7），5.23 （s，1H，H-28b），4.51 （t，J＝7.4 Hz，1H，H-16），4.26 （d，J＝3.4 Hz，2H，H-29），1.81（s，3H，H-26），1.74 （d，J＝3.5 Hz，3H，H-27），1.49 （s，3H，H-30），1.07 （d，J＝3.5 Hz，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）数据见表1。以上波谱数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定化合物5为茯苓新酸ZC。

化合物6：白色无定形粉末。分子式C30H46O6。ESI-MSm/z：501 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.75 （s，1H，H-28a），5.35 （d，J＝8.6 Hz，1H，H-24），5.15 （s，1H，H-28b），4.48 （m，1H，H-16），1.62 （s，3H，H-27），1.60 （s，3H，H-26），1.48 （s，3H，H-30），1.17 （s，3H，H-18），1.05 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）数据见表1。以上波谱数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定化合物6为茯苓新酸ZM。

化合物7：白色无定形粉末。分子式C30H44O6。ESI-MSm/z：499 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.45 （d，J＝7.3 Hz，1H，H-24），5.30（d，J＝7.7 Hz，1H，H-11），5.26 （d，J＝8.8 Hz，1H，H-7），4.81 （s，1H，H-28a），4.75 （s，1H，H-28b），4.51 （d，J＝11.9 Hz，1H，H-27a），4.47 （m，3H，H-16），4.42 （d，J＝11.6 Hz，1H，H-27b），1.95 （s，3H，H-26），1.71 （s，3H，H-29），1.46 （s，3H，H-30），1.06 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）数据见表2。以上波谱数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定化合物7为茯苓新酸E。

表2 化合物7～11的13C-NMR数据 (150 MHz，C5D5N)Tab 2 13C-NMR data for compounds 7～11 (150 MHz，C5D5N)

化合物8：白色无定形粉末。分子式C31H46O6。ESI-MSm/z：513 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.48 （s，1H，H-11），5.33 （d，J＝5.1 Hz，1H，H-11），5.29 （d，J＝3.9 Hz，1H，H-7），5.16 （s，1H，H-31b），4.83 （d，J＝2.9 Hz，1H，H-28a），4.76 （d，J＝2.7 Hz，1H，H-28b），4.53（dd，J＝8.4，6.1 Hz，1H，H-16），3.01 （m，1H，H-20），2.89 （ddd，J＝10.8，6.0，2.7 Hz，1H，H-17），2.34 （d，J＝7.3 Hz，1H，H-5），1.73 （s，3H，H-29），1.55 （s，3H，H-27），1.54 （s，3H，H-26），1.49 （s，3H，H-30），1.09 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）数据见表2。以上波谱数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定化合物8为茯苓新酸D。

化合物9：白色无定形粉末。分子式C30H46O6。ESI-MSm/z：501 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.34 （s，1H，H-11），5.29 （m，1H，H-7），4.82 （s，1H，H-28a），4.76 （s，1H，H-28b），4.50 （t，J＝9.5 Hz，1H，H-16），1.75 （s，3H，H-29），1.49 （s，3H，H-30），1.36 （s，6H，H-26，27），1.09 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）数据见表2。以上波谱数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定化合物9为茯苓新酸ZG。

化合物10：白色无定形粉末。分子式C30H46O7。ESI-MSm/z：517 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.33 （brs，1H，H-11），5.27 （brs，1H，H-7），4.83 （s，1H，H-29a），4.77 （s，1H，H-29b），4.53 （m，1H，H-16），3.84 （m，1H，H-24），1.73 （s，3H，H-28），1.49 （s，6H，H-27，30），1.45 （s，3H，H-26），1.07 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR （150 MHz，C5D5N）数据见表2。以上波谱数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定化合物10为茯苓新酸M。

化合物11：白色无定形粉末。分子式C31H46O7。[α]25D30.8 （c 0.7，CH3OH）；ESI-MSm/z：529 [M-H]－。1H-NMR （600 MHz，C5D5N）δH：5.60 （s，1H，H-31a），5.33 （d，J＝4.6 Hz，1H，H-31b），5.32 （s，1H，H-11），5.28 （d，J＝3.8 Hz，1H，H-7），4.83 （s，1H，H-29a），4.77 （s，1H，H-29b），4.53 （t，J＝7.4 Hz，1H，H-16），1.74 （s，3H，H-28），1.66 （s，3H，H-27），1.49 （s，3H，H-30），1.08 （s，3H，H-18），1.03 （s，3H，H-19）。13C-NMR（150 MHz，C5D5N）数据见表2。以上波谱数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定化合物11为茯苓新酸L。同时针对C-25位立体构型确定，将化合物11与Mo2（OAc）4试剂以二甲基亚砜（DMSO）为溶剂混合后测定ICD图谱（见图2）。图中314 nm处Cotton效应为负，根据Snatzke经验规则[12]，该二醇体系的二面角扭角为逆时针方向，从而确定化合物中C-25位的绝对构型为25R。

图2 化合物11与Mo2（OAc）4的配合物在DMSO中的CD图谱Fig 2 CD spectra of in situ formed Mo2（OAc）4 complexes of 11 recorded in DMSO

4 讨论

临床用药中的茯苓皮、茯苓和茯神均来源于茯苓菌核，但药用部位不同，功效作用也不相同，茯神长于宁心益智从而安神，茯苓长于健脾渗湿，赤茯苓长于行水利湿、益心润肺，茯苓皮长于利水消肿。茯苓的主要化学成分为多糖、三萜类、甾醇等。王宏侠[13]的研究表明茯苓皮、茯神、茯苓中总三萜含量依次升高，按植物形态学由内及外的顺序，茯神、茯苓、赤茯苓、茯苓皮中3，4-裂环-羊毛甾茯苓三萜类化合物含量相对增高，而闭环羊毛甾茯苓三萜类化合物含量相对降低，通过主成分分析（PCA）法寻找的茯神、茯苓、茯苓皮差异化合物为茯苓新酸D、松苓酸，通过t-检验寻找的茯神与茯苓、茯苓皮的差异化合物为26-羟基茯苓新酸G、16-α-乙酰氧基-羊毛甾-8，24-二烯-21-酸、羊毛甾-7，9（11），24-三烯-21-酸[13]。

三萜类成分类型和含量可能为茯神功效区别于茯苓的重要物质基础[14]。本研究从茯神中分离得到11个裂环羊毛甾烷类化合物，其中6个化合物为首次从茯苓的药用部位茯神中得到，进一步丰富了茯神的化学成分种类，可为今后发掘茯神安神宁心的药效物质基础提供科学依据。