基于电子鼻技术结合网络药理学分析半夏不同炮制品的气味差异标志物

杨靖涵，高杰，孙立丽，刘亚男，任晓亮（天津中医药大学中药学院，天津 301617）

半夏为天南星科植物半夏Pinelliaternata（Thunb.）Breit.的干燥块茎，归脾、胃、肺经。现代研究表明，半夏的化学成分主要包括生物碱[1]、有机酸[2]、挥发油[3]、氨基酸[4]等，半夏具有脏器毒性、黏膜刺激性、生殖毒性等毒副作用，炮制可以减少生品的毒性，从而达到减毒增效、改变药性的目的[5]。2020年版《中国药典》收载的半夏的炮制品主要有半夏、姜半夏、法半夏、清半夏四种[6]。药理学研究证实半夏具有镇咳、祛痰、止呕、抗炎、抗氧化的功效，而半夏的不同炮制品在临床中均具有止咳的作用[7-8]。王锐等[9]采用“同时蒸馏-萃取”的方法提取了半夏的挥发油，并证明了半夏的挥发油具有一定的生理活性。也有研究表明，半夏挥发油具有止咳、抗炎、抗氧化等功效，这与半夏的药理作用具有较好的相关性[1，10-11]。因此从半夏挥发油中筛选质量标志物是可行的思路。

半夏的炮制工艺多以复制法为主，经炮制后挥发性的成分种类差异较大，因此通过建立指纹图谱探索共有的化学特征，进而确定其质量标志物是有效可行的思路[12-16]。Heracles Ⅱ超快速气相电子鼻的分析原理与气相色谱类似，物质中的挥发性成分不同，对色谱柱的吸附与解吸也存在较大差异，能够实现混合气体之间的分离与分析[17]，和气相色谱相比，具有更短的色谱柱和更薄的填充材料，能够极大缩短挥发性成分的分离时间，提高样品分析效率[18]，其配备的Arochembase数据库具有类似于GC-MS的成分定性功能。因此超快速气相电子鼻具有操作简单，检测快捷，无需对样品做过多处理等优点，能够对中药成分进行快速的分离、定性、分析[19]。目前已被广泛用于中药材基原[20]、炮制品[21]、掺伪品[22]、采收期和贮存期[23]等方面的研究中。本研究借助Heracles Ⅱ超快速气相电子鼻技术获得半夏及其炮制品的气相色谱图，建立半夏不同炮制品的超快速气相电子鼻检测方法，并分析了半夏不同炮制品之间的气味成分及差异标志物，进一步结合网络药理学，预测不同炮制品的差异成分靶点和通路信息，旨在从挥发性成分的角度，解释半夏不同炮制品的分子作用机制，为炮制品的质量控制研究提供新思路。

1 样品、仪器与试药

1.1 样品

半夏收集于河北、四川、甘肃等地，具体样品批次见表1，经天津中医药大学窦志英教授鉴定为天南星科植物半夏Pinelliaternate（Thunb.）Breit.的块茎。所有样品均按2020年版《中国药典》[6]中半夏炮制方法自制4 种半夏炮制品。

表1 样品来源信息Tab 1 Sample source information

1.1.1 半夏 取半夏药材，除去杂质，即得样品SBX-S1～S6。

1.1.2 姜半夏 选取直径大小约为1 cm的净制半夏，用水浸泡至内无干心时，取出；另取生姜片煎汤，加白矾与半夏共煮透，取出，晾干。即得样品JBX-S1～JBX-S6。每100 g净制半夏用生姜25 g，白矾12.5 g。

1.1.3 法半夏 选取直径大小约为1 cm的净制半夏，用水浸泡至内无干心。取适量甘草，加水煎煮，合并煎液，倒入适量的石灰液中，加入浸透的半夏，每日搅拌1～2 次，保持溶液pH 12以上，至剖面黄色均匀，口尝微有麻舌感时取出，洗净，晾干，即得样品FBX-S1～FBX-S6。每100 g净制半夏用甘草15 g，生石灰10 g。

1.1.4 清半夏 选取直径大小约为1 cm的净制半夏，用8%的白矾水浸泡至内无干心，口尝微有麻舌感时取出，洗净，晾干。即得样品QBXS1～QBX-S6。每100 g净制半夏用白矾20 g。

将以上4种炮制品分别打粉，过4号药典筛，备用。精密称取药材粉末0.5 g，分别置于20 mL顶空进样瓶中，加盖密封，平行两次进样。半夏不同炮制品见图1。

图1 半夏及其不同炮制品Fig 1 Pinelliae Rhizoma and its processed products

1.2 仪器与试药

HeraclesⅡ超快速气相电子鼻（法国Alpha MOS公司）；FA2004型万分之一天平，（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。nC6-nC16正构烷烃标准溶液（批号：563121，美国RESTEK公司）。

2 方法与结果

2.1 Heracles Ⅱ超快速气相电子鼻仪器条件

Heracles Ⅱ超快速气相电子鼻配有两根色谱柱：一根为非极性的MXT-5色谱柱，另一根为弱极性的MXT-1701色谱柱。待测样品通过平行工作的两根色谱柱进行分离后，使用氢火焰离子检测器FID对分离出的物质进行检测，从而得到半夏及其炮制品的有效气味信息，具体分析条件参数如表2所示。

表2 Heracles Ⅱ超快速气相电子鼻分析条件Tab 2 Analysis conditions of Heracles Ⅱultra-fast gas phase electronic nose

2.2 炮制品气味成分定性分析

根据“2.1”项下条件，将所得图谱信息导入Origin Pro 2022软件得到半夏及其炮制品的色谱图（如图2所示），得半夏不同炮制品对照气味峰指纹图谱（如图3所示）。利用正构烷烃标准溶液对各气味信息进行定性，样品保留时间校准为Kovats保留指数，利用Arochembase数据库和Alphasoftv12.44软件处理后，得到半夏及其炮制品的可能气味信息如表3所示。

图2 半夏不同炮制品气味指纹图谱Fig 2 Odor fingerprint of Pinelliae Rhizoma and its processed products

图3 半夏及其炮制品对照气味峰指纹图谱比较Fig 3 Common mode of odor fingerprint of Pinelliae Rhizoma and its processed products

表3 半夏及其不同炮制品可能气味信息Tab 3 Possible compounds information of Pinelliae Rhizoma and its processed products

结果表明，4种炮制品气味之间的共有成分为正十三烷；半夏的特有气味成分为2-甲基丙酸乙酯、正己醛、壬酸丙酯、丙戊酸、5-甲基十五烷、肉桂酸正丙酯；姜半夏的特有气味成分为正己烷、3-戊酮、2-甲基-1-戊醇、苯甲酸、4-三癸醇；法半夏的特有气味成分为甲酸甲酯、甲基丁香酚；清半夏的特有气味成分为二乙基酮、正十六烷。由此可见半夏不同炮制品之间气味存在差异，因此这些不同的气味信息可能是鉴别半夏及其炮制品的物质基础。

2.3 半夏不同炮制品气味成分分析

利用电子鼻获取半夏不同炮制品气味信息，通过Kovats保留指数定性，采用峰面积归一化法得到半夏不同炮制品的气味成分相对含量。结果见表4。半夏不同炮制品中共鉴定出21种成分，包括酯类6种，烷烃类5种，醇类2种，酸类2种，醛类、酚类各1种，其他类4种。

表4 半夏及其不同炮制品气味成分相对含量Tab 4 Relative content of odorant components in Pinelliae Rhizoma and its different processed products

结果表明，半夏不同炮制品中，共同存在的成分为酯类和烃类。半夏的气味成分主要为酯类、烃类、酸类、醛类；姜半夏的气味成分主要为酯类、烃类、醇类、酸类；法半夏的气味成分主要为酯类、烃类、酚类等；清半夏的气味成分主要为酯类、烃类。其中，姜半夏炮制过程中加入炮制辅料生姜，赋予了姜半夏辛辣的、香料的气味；法半夏炮制过程中加入辅料甘草汁，赋予了法半夏甜的、水果的气味，这表明不同的物料对半夏不同炮制品的影响不尽相同，因此炮制后的化学成分、药效、作用机制也会有所改变[24]。

2.4 多元统计分析

2.4.1 主成分分析（PCA） 根据Heracles Ⅱ超快速气相电子鼻得到半夏及其炮制品的色谱图，以其色谱图峰面积为变量进行PCA分析，结果如图4所示。判别指数为70，主成分（PC1＝54.424%，PC2＝18.414%）的累计贡献率为72.838%，表明所建立的模型能够较好地反映样品的气味信息。四种炮制品能够被良好地区分：半夏主要分布在第二、三象限，且样品分布较为分散，说明样品之间气味差异较大；姜半夏、法半夏、清半夏主要分布在第一、四象限，与半夏分布距离较远，且这三种炮制品之间也能较好地区分。以上结果表明半夏的不同炮制品之间存在气味差异，PCA模型可以用于区分半夏及其炮制品，后续可以进一步使用有监督模型进一步分析。

图4 PCA模型得分图Fig 4 PCA model score chart

2.4.2 判别因子分析（DFA） DFA是在PCA模型的基础上，扩大组间的差异，缩小组内的差异的一种分析方法[25-26]。DFA模型的得分图如图5所示，样品按照不同的炮制方法分为4类。判别因子（DF1＝70.299%，DF2＝22.999%）的累计贡献率为93.298%，DFA模型能较好地区分半夏不同炮制品。半夏沿着DF1的正半轴分布，沿着DF1方向姜半夏、法半夏、清半夏距离半夏生品的距离较远，有着明显的界限，说明半夏经炮制后气味成分信息差异较大；各个炮制品中，姜半夏和法半夏主要分布在第三象限，清半夏则主要分布在第一象限，姜半夏和法半夏的距离相对较近，说明姜半夏和法半夏的气味信息较为相似，而清半夏的气味信息则与这两种炮制品的气味信息有较大的差异。半夏和不同炮制品之间距离有着明显的界限，结果与PCA模型分析结果一致。

图5 DFA模型得分图Fig 5 DFA model score chart

2.4.3 偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA） 采用IBM SPSS Statistics对21个气味色谱峰进行单因素方差分析，结果如表5所示，除正己烷外的其他20个峰均有显著性差异（P＜0.05）；采用SIMCA14.1软件对21个峰进行PLS-DA分析，生成的VIP图如图6所示。结果表明，模型解释概率R2Y为0.967，模型预测率Q2为0.959，表明模型具有较好的解释率和可靠性。选取VIP值大于1的变量作为潜在气味差异标志物。其中甲基丁香酚、二乙基酮、正十六烷、辛酸庚酯、丙烯酸丙酯的VIP值大于1，推测这5个成分是影响半夏及其炮制品气味的差异标志物。

图6 半夏及其炮制品PLS-DA模型中21个色谱峰VIP值Fig 6 VIP values of 21 chromatographic peaks in PLS-DA models of Pinelliae Rhizoma and its processed products

表5 半夏及其炮制品组别间气味成分方差分析Tab 5 Variance analysis of odor components among Pinelliae Rhizoma and its processed products

2.5 半夏不同炮制品气味差异成分网络药理学分析

2.5.1 差异物靶点预测分析 在PubChem数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound）中检索半夏炮制前后差异性气味成分的丁香酚、二乙基酮、正十六烷、辛酸庚酯、丙烯酸丙酯的SIMILES号，导入Swiss Target Prediction数据库（https：//www.swisstargetprediction.ch/），选择Probability＞0.1进行筛选和靶点预测分析，利用Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）将靶点蛋白转换成标准基因名，筛去重复的靶点，最终得到与其有作用的靶点共133个。

2.5.2 疾病基因靶点的获取 在GeneCard和DisGeNET数据库中检索关键词“Cough”，将所得数据合并，去除重复值，获得疾病靶点的相关信息，共得到了1823个作用靶点，将药物主要成分与疾病基因取交集，共得到48个共同靶点。

2.5.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建 将筛选的48个靶点导入STRING数据库（https：//www.string-db.Org）构建PPI网络，物种选择为“Homo sapiens”，最低关联度值选择为＞0.4，得到差异性成分潜在作用靶点的PPI网络图。将其以TSV格式导入Cytoscape3.9.1中，进行可视化和拓扑分析。筛选出标准值＞2倍Degree的中位数值，1倍Betweenness和Closeness的中位数值，筛选出发挥活性的核心靶点，包括Toll样受体4（TLR4）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、雌激素受体（ESR1）、糖原合酶激酶3（GSK3B）、丝裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）等。

2.5.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析 利用David数据库（https：//www.david.ncifcrf.gov/tools.jsp）对筛选的核心靶点进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。选择生物属性为“Homo sapiens”，标识符号为“OFFICIAL-GENE-SYMBOL”，列表选择为“Gene List”。GO功能富集共得206个条目，其中BP通路（biological process）206条，CC通路（cellular component）45条，MF通路（molecular function）50条。取前10条绘制为条形图，如图7A所示。其中BP通路主要包括对脂多糖的反应、蛋白质磷酸化通路、腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联受体信号传导通路等；CC通路主要包括质膜、细胞质、高分子通路等；MF主要包括蛋白激酶信号通路、G蛋白耦联腺苷受体信号通路、ATP结合受体通路等。共得KEGG富集的92条通路，取前20条通路，绘制KEGG气泡图，如图7B所示，主要涉及的通路为PI3K-Akt信号通路、表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制通路、Coronavirus disease-COVID-19信号通路、乙型病毒型肝炎信号通路等。进一步利用Cytoscape 3.9.1绘制“成分-靶点-通路”图，如图8所示。

图7 GO功能富集分析（A）和KEGG通路富集分析（B）Fig 7 GO functional enrichment analysis（A）and KEGG pathway enrichment analysis（B）

图8 半夏挥发性成分-靶点-通路网络Fig 8 Volatile component-target-pathway network of Pinelliae Rhizoma

3 讨论与结论

目前已有大量实验从半夏不同炮制品的非挥发性成分角度探究其止咳的机制，但尚未有从挥发性成分角度进行研究的报道。气味是中药较为重要的一个属性，半夏不同炮制品之间气味差异明显，其内在的化学成分更是不同炮制品发挥药效的重要依据。本研究运用了Heracles Ⅱ超快速气相电子鼻技术，在预实验考察了进样量、震荡时间、震荡温度等实验条件后最终确立了最优实验条件，实现了对半夏不同炮制品挥发性成分的快速检测，获取了相关的气相色谱信息，并基于此建立了半夏不同炮制品的气味指纹图谱。电子鼻共定性出21种可能存在的气味特征性成分，明确了炮制前后各炮制品气味种类和相对含量的变化。半夏经炮制后醛类成分消失，增加了如2-甲基-1-戊醇、4-三癸醇、甲基丁香酚、乙基氯、二乙基酮等醇类、酚类和其他类的成分。姜半夏的炮制过程中加入生姜能够缓和半夏的刺激性，半夏经炮制后挥发油的相对含量减少，挥发性成分的种类数增加，因此姜半夏炮制的减毒机制尚需进一步研究[24]；法半夏的炮制过程中引入了甘草汁，气味研究结果表明炮制后法半夏新增甲基丁香酚这一物质，现代药理学已证实甲基丁香酚能够松弛气道平滑肌，从而起到镇咳、平喘的作用[25-26]，推测甘草的加入使得法半夏的止咳作用增强。利用PCA、DFA、PLS-DA等多元分析方法，筛选出了5种气味差异性成分。

进一步利用网络药理学，基于筛选出的5种气味差异性成分，探究半夏不同炮制品止咳的分子作用机制。绘制PPI网络，共筛选出48个靶点蛋白，其中核心靶点蛋白包括Toll样受体4（TLR4）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、雌激素受体（ESR1）、糖原合酶激酶3（GSK3B）、丝裂原激活蛋白激酶14（MAPK14）等。TLR4可有效杀伤T细胞及激活树突状细胞，在介导细胞因子、调控气道炎性介质的释放方面具有重要的调控作用[27-29]；CASP3与细胞凋亡关系密切，其位于两条细胞凋亡通路的中心，活化后可参与切割细胞结构和功能蛋白，较好地反映凋亡过程[30-31]；ESR1与雌激素相关，可能在肺部疾病中起关键作用[32]；GSK3B参与调控糖原合成酶的活性，调节细胞的分化、增殖和凋亡等[33]，MAPK14主要参与细胞生长、分化、应激、炎症反应等多种细胞活动[34-35]。此外，MAPK14的激活是一种氧化和触发黏附蛋白的调节器，能够磷酸化激活MAPKAP2来增强炎性因子的表达和分泌[36]。

KEGG富集分析主要涉及的通路为PI3K-Akt信号通路、表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制通路、乙型病毒型肝炎信号通路等。研究证明，PI3K/Akt信号通路的激活会使得气道中的炎性因子迁移到炎性病灶中，同时PI3K/Akt信号通路在支气管哮喘中也表现出有效的抗炎活性[33，37]。EGFR信号通路在维持上皮细胞稳定性、促进气道上皮组织修复方面起着至关重要的作用[30，38]。乙型病毒性肝炎通路表现为直接或间接与免疫和炎症相关，说明半夏不同炮制品在抗炎方面发挥着一定的作用[39]。

综上所述，本实验在比较研究半夏炮制前后成分变化的基础上，联合网络药理学初步探讨了半夏炮制增效的原理，对“药物-成分-靶点”关系网络中关键成分分析，发现原料药材与炮制辅料均在治疗疾病的过程中发挥重要作用。根据网络药理学的结果推测，半夏不同的炮制品中的甲基丁香酚、二乙基酮、正十六烷等物质作为潜在的止咳有效成分，通过TLR4、CASP3、ESR1等关键靶点，调节PI3K-Akt、EGFR等信号通路的激活，从而抑制组织炎症反应和气道结构重塑，发挥止咳的作用。本研究从分子作用机制的角度阐释半夏中挥发性成分的止咳作用机制，今后将通过相关生物学实验，验证半夏不同炮制品在药性与临床止咳作用之间的联系与差别。