不同基原淫羊藿和巫山淫羊藿药材的化学成分差异研究

田祥木，李天娇，2，3，李强，杨欣欣，2，3，王帅，2，3*，包永睿，2，3*，孟宪生，2，3（.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 6600；2.辽宁省中药多维分析专业技术创新中心，辽宁 大连 6600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 6600：.河北百草康神药业有限公司，河北 衡水 053800）

2020年版《中国药典》中收载淫羊藿药材及巫山淫羊藿药材[1]，其中淫羊藿包括4种基原植物，分别为淫羊藿EpimediumbrevicornuMaxim.、箭叶淫羊藿Epimediumsagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.、朝鲜淫羊藿EpimediumkoreanumNakai，巫山淫羊藿基原为巫山淫羊藿EpimediumwushanenseT.S.Ying。目前该不同基原巫山淫羊藿及淫羊藿为市场上广泛销售的品种。而5种药材的产地也有所不同，淫羊藿主要分布于贵州省；箭叶淫羊藿主要分布于浙江省、安徽省等地；柔毛淫羊藿主要分布于湖北省、四川省等地；朝鲜淫羊藿主要分布于吉林省、辽宁省等地；巫山淫羊藿主要分布于四川省、贵州省等地。淫羊藿及巫山淫羊藿药材分布的广泛性以及其资源分布的交叉性，导致了在淫羊藿及巫山淫羊藿药材的使用方面较为混乱。

在功效方面淫羊藿及巫山淫羊藿均为补肾阳、强筋骨、祛风湿，用于肾阳虚衰、阳痿遗精、筋骨痿软、风湿痹痛、麻木拘挛。但在临床药理药效评价中有所不同，具体表现在改善肾功能指标、抗氧化作用及对血清睾酮的影响等方面[2]。药材化学成分的差异可以直接影响其药效的差异。经过文献查阅发现[3]，有文献对不同基原淫羊藿药材的化学成分进行分析，但其中并未包含巫山淫羊藿，且质量评价所选定的化合物数量较少，故本文从淫羊藿及巫山淫羊藿药材的化学成分的数量与相对含量角度，探讨不同基原药材化学成分的差异，及快速鉴定巫山淫羊藿及淫羊藿不同基原药材的方法。

本试验以探讨巫山淫羊藿及淫羊藿5种不同药材化学成分为目的，采用UPLC-Q-TOF-MS技术对淫羊藿及巫山淫羊藿药材的化学成分进行鉴定，通过与对照品比对及相关文献报道，共鉴定出37种化学成分，并对5种药材化学成分鉴定的结果进行对比分析，通过SIMCA数据处理软件对化学成分的相对含量进行统计学分析，现报道如下。

1 材料

安捷伦1290 InfinityⅡ液相色谱仪、安捷伦6550 iFunnel Q-TOF LC/MS质谱仪（美国安捷伦科技有限公司），ME55/02电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。色谱纯甲醇、质谱纯甲醇（德国默克集团），质谱甲酸（赛默飞世尔公司），纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

对照品淫羊藿苷（批号：wkq21042608）、朝霍定A（批号：wkq21060111）、朝霍定B（批号：wkq21071613）、朝霍定C（批号：wkq21031304）、宝霍苷Ⅰ（批号：wkq21071508）、宝藿苷Ⅱ（批号：wkq21081105）、川陈皮素（批号：wkq19012502）、新橙皮苷（批号：wkq21020406）、淫羊藿次苷Ⅰ（批号：wkq21071908）、山柰苷（批号：wkq21072107）（纯度≥ 98%，四川省维克奇生物科技有限公司），金丝桃苷（批号：18090816）、木兰花碱（批号：17020802）（纯度≥ 98%，成都普菲德生物技术有限公司），山柰酚-3-O-鼠李糖苷（批号：HR232W11）、紫云英苷（批号：HS16824B1）、淫羊藿素（批号：HR3508W4）、箭霍苷B（批号：HS198266B2）（纯度≥ 98%，宝鸡市渭滨区新仪科技仪器经营部）。

巫山淫羊藿与淫羊藿于2022年5月采自贵州省，柔毛淫羊藿与箭叶淫羊藿于2022年5月采自四川省，朝鲜淫羊藿于2022年5月采自辽宁省，经辽宁中医药大学张建奎教授分别鉴定为小檗科淫羊藿属巫山淫羊藿EpimediumwushanenseT.S.Ying的干燥叶、小檗科淫羊藿属淫羊藿Epimedium brevicornuMaxim.的干燥叶、小檗科淫羊藿属柔毛淫羊藿EpimediumpubescensMaxim.的干燥叶、小檗科淫羊藿属箭叶淫羊藿Epimediumsagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.的干燥叶、小檗科淫羊藿属朝鲜淫羊藿EpimediumkoreanumNakai的干燥叶。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

精密称取淫羊藿粉末约1 g（过3号筛），置具塞锥形瓶中，加入25 mL甲醇，称重，超声提取30 min，取出，放冷，用甲醇补足失重，用0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取各对照品适量，用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，即得对照品溶液（金丝桃苷、淫羊藿素、淫羊藿苷、朝霍定B、宝霍苷I、宝藿苷Ⅱ、新橙皮苷、紫云英苷、淫羊藿次苷I、淫羊藿次苷A、山柰苷、箭霍苷B、朝霍定A、朝霍定C、川陈皮素、木兰花碱、山柰酚-3-O-鼠李糖苷质量浓度分别为0.103、0.098、0.101、0.104、0.099、0.100、0.097、0.103、0.099、0.101、0.106、0.099、0.109、0.100、0.099、0.104、0.097 mg·mL－1）。

2.3 色谱条件

2.3.1 色谱条件 色谱柱为Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），正离子模式下流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为甲醇，梯度洗脱（0～30 min，5%～100%B）；负离子模式下流动相A为水，流动相B为甲醇，梯度洗脱（0～30 min，5%～100%B）。两种模式下进样量均为0.1 μL，流速为0.4 mL·min－1，柱温为30℃。

2.3.2 质谱条件 电喷雾离子源，正离子测定模式，毛细管电压：4000 V，鞘气温度为350℃，干燥气体温度为250℃，鞘气流速为11 L·min－1，干燥气体流速为13 L·min－1，雾化器压力为45 psi，碎裂电压为125 V，质量范围为100～1500m/z；负离子测定模式，除毛细管电压为3500 V以外，其他质谱条件与正离子相同。所得数据采用MassHunter Qualitative Analysis B.06.00软件处理。

2.4 测定

取“2.1”项下方法制备的供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件对淫羊藿及巫山淫羊藿不同基原药材进行UPLC-Q-TOF-MS分析。所得样品色谱图见图1。

图1 淫羊藿及巫山淫羊藿药材的质谱图Fig 1 Mass spectra of different basal herbs of Epimedium and Wushan Epimedium

3 结果

3.1 基于UPLC-Q-TOF-MS的淫羊藿药材化学成分鉴定

运用UPLC-Q-TOF-MS技术，对淫羊藿及巫山淫羊藿药材的化学成分进行解析，根据各化学成分的保留时间以及质谱碎裂信息等，结合所提取的总离子流图和相关文献报道进行数据对比，指认化学成分。巫山淫羊藿中检测出37种化学成分，淫羊藿中检测出32种化合物，柔毛淫羊藿中检测出34种化合物，箭叶淫羊藿检测出33种化合物，朝鲜淫羊藿中检测出32种化合物。具体分布情况见表1。

表1 淫羊藿及巫山淫羊藿药材中化学成分鉴定结果Tab 1 Identification of chemical components in Epimedium and Wushan Epimedium herbs

3.2 淫羊藿及巫山淫羊藿药材中部分化合物质谱裂解规律

化合物1保留时间为7.297 min，一级质谱图中得到其准分子离子峰为m/z151.0398 [M-H]－，推测其分子式为C8H8O3。在二级质谱图中发现碎片离子m/z136.1058 [M-H-O]－，m/z108.0212 [M-HCO2]－。通过与化合物异香草醛的碎片离子进行比较[3]，与化合物异香草醛的质谱碎片一致，推测化合物1为异香草醛。化合物2保留时间为8.754 min，一级质谱图中得到其准分子离子峰为m/z549.1937 [M＋H]＋，故推测其分子式为C27H32O12。在二级质谱图中发现碎片离子m/z387.1424 [M＋H-C6H10O5]＋，m/z297.0818 [M＋H-C9H16O8]＋。通过与化合物茂藿苷A的碎片离子进行比较[4]发现与其质谱碎片一致，推测化合物2为茂藿苷A。化合物4保留时间为11.880 min，一级质谱图中得到其准分子离子峰为m/z463.0873 [M-H]－，故推测其分子式为C21H20O12。在二级质谱图中发现碎片离子m/z402.8090 [M-H-CH2O3]－，m/z344.0462[M-H-C4H8O4]－，m/z314.0353 [M-H-C5H10O5]－，m/z301.0299 [M-H-C6H11O5]－，m/z271.0225 [M-HC7H13O6]－。通过与金丝桃苷对照品的碎片离子进行比较发现与其质谱碎片一致，推测化合物4为金丝桃苷。化合物5保留时间为11.896 min，一级质谱图中得到准分子离子峰为m/z579.1697 [M-H]－，故推测其分子式为C27H32O14。二级质谱图中发现碎片离子m/z271.0599 [M-H-C12H21O9]－，m/z151.0034[M-H-C20H28O10]－，m/z119.0495 [M-H-C19H25O13]－。通过与化合物柚皮苷的碎片离子进行比较[6]发现与其质谱碎片一致，推测化合物5为柚皮苷。化合物6保留时间为12.310 min，一级质谱图中得到准分子离子峰为m/z593.1494 [M-H]－，故推测其分子式为C27H30O15。二级质谱图中发现碎片离子m/z446.0825 [M-H-C6H12O4]－，m/z299.0178[M-H-C12H23O8]－，m/z271.0225 [M-H-C13H23O9]－。通过与化合物槲皮素-3，7-二-O-鼠李糖苷的碎片离子进行比较[7]发现与其质谱碎片一致，推测化合物6为槲皮素-3，7-二-O-鼠李糖苷。化合物7保留时间为12.641 min，一级质谱图中发现其准分子离子峰为m/z609.1800 [M-H]－，故推测其分子式为C28H34O15。二级质谱图中发现碎片离子m/z343.0814 [M-H-C10H19O8]－，m/z302.0722 [M-HC12H20O9]－，m/z286.0459 [M-H-C12H20O10]－。通过与新橙皮苷对照品的碎片离子进行比较发现与其质谱碎片一致，推测化合物7为新橙皮苷。化合物8保留时间为13.170 min，一级质谱图中发现其准分子离子峰为m/z447.0922 [M-H]－，故推测其分子式为C21H20O11。二级质谱图中发现碎片离子m/z301.0311 [M-H-C5H7O5]－，m/z285.0375[M-H-C6H11O5]－，m/z255.0272 [M-H-C7H13O6]－，m/z162.9586 [M-H-C13H18O7]－，m/z123.0105 [M-HC15H17O8]－。通过与紫云英苷对照品的碎片离子进行比较发现与其的质谱碎片一致，推测化合物8为紫云英苷。化合物19保留时间为17.340 min，一级质谱图中发现其准分子离子峰为m/z837.2788[M-H]－，故推测其分子式为C39H50O20。二级质谱图中发现碎片离子m/z676.2387 [M-H-C6H10O5]－，m/z675.2259 [M-H-C6H11O5]－，m/z645.2136 [M-HC7H13O6]－，m/z366.1102 [M-H-C18H32O14]－。通过与朝霍定A对照品的碎片离子进行比较发现与其质谱碎片一致，推测化合物19为朝霍定A。化合物26保留时间为18.895 min，一级质谱图中发现其准分子离子峰为m/z691.2204 [M-H]－，故推测其分子式为C33H40O16。二级碎片离子m/z545.1640[M-H-Rha]－，m/z529.1692 [M-H-Glc]－，m/z383.1100 [M-H-Rha-Glc]－，m/z368.0911 [M-H-Rha-Glc-CH3]－，m/z313.0375 [M-H-Rha-Glc-C3H3O]－。通过与化合物sagittasine C的碎片离子进行比较[7，11]发现与其的质谱碎片一致，推测化合物26为sagittasine C。化合物30保留时间为20.120 min，一级质谱图中发现其准分子离子峰为m/z499.1592[M-H]－，故推测其分子式为C26H28O10。二级碎片离子m/z353.0999 [M-H-C6H11O4]－，m/z309.0375[M-H-C9H19O4]－，m/z281.0428 [M-H-C10H19O5]－。通过与宝藿苷Ⅱ对照品的碎片离子进行比较发现与其质谱碎片一致，推测化合物30为宝藿苷Ⅱ。化合物36保留时间为22.403 min，一级质谱图中发现其分子离子峰为m/z513.1757 [M-H]－，故推测其分子式为C27H30O10。二级碎片离子m/z486.1852 [M-H-C2H4]－，m/z445.1077 [M-H-C5H9]－，m/z367.1118 [M-H-C7H15O3]－，m/z324.0931 [M-HC9H18O4]－，m/z217.0484 [M-H-C15H21O6]－。通过与宝霍苷Ⅰ对照品的碎片离子进行比较发现与其的质谱碎片一致，推测化合物36为宝霍苷Ⅰ。

3.3 正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）

取“2.1”项下方法制备的供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件对不同基原淫羊藿及巫山淫羊藿药材进行UPLC-Q-TOF-MS分析，结合淫羊藿中所含化学成分，将所有成分在淫羊藿及巫山淫羊藿药材中相对含量进行统计，并将数据导入SIMCA软件进行OPLS-DA分析。图2A的OPLS-DA结果表明不同基原淫羊藿及巫山淫羊藿药材可以明显区分，存在组间差异。为了更加直观地观察组间差异，本研究采用有监督的OPLS-DA分析方法，筛选淫羊藿及巫山淫羊藿5种药材的差异化合物。由OPLS-DA结果可知，R2X（cum）＝0.974，R2Y（cum）＝0.956，Q2（cum）＝0.853，表明模型的解释度及预测度良好。根据变量重要投影（VIP）筛选出差异化合物，其中VIP值越大表明该化合物对分类的贡献越大，当VIP值＞1时，表示该变量对分类起到关键性作用。本研究VIP值如图2C所示，从图中可以发现VIP＞1的化合物由大到小依次为淫羊藿定L、2''-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、木兰花碱、新橙皮苷、紫云英苷、epimedokoreanoside 或其异构体、宝霍苷Ⅰ、山柰苷、大黄素、朝藿定Ⅰ、淫羊藿苷、朝霍定A共12种成分。同时为了验证OPLS-DA模型的有效性，进行了200轮置换测试。如图2B所示，左侧所有蓝色Q2值均低于右侧原点，且Q2蓝色回归线与垂直轴在零点或以下相交，表示该模型是可靠的。

图2 不同基原淫羊藿及巫山淫羊藿药材OPLS-DA分析结果Fig 2 OPLS-DA analysis of different basal herbs of different basal epimedium and Wushan epimedium

4 讨论

经过相关文献报道[13]，黄酮类成分为淫羊藿药材中主要的活性成分，故本研究以黄酮类成分为主进行淫羊藿药材化学成分差异性研究。通过对不同基原淫羊藿及巫山淫羊藿药材的化学成分进行分析鉴定，共鉴定出37种化合物，其中共同含有的化学成分包括宝霍苷Ⅰ、淫羊藿素、宝霍苷Ⅰ、淫羊藿次苷Ⅰ、sagittasine C、箭霍苷C、朝霍定A、朝霍定B、朝霍定C、宝藿苷Ⅶ、淫羊藿苷、大黄素、淫羊藿新苷A、淫羊藿属苷C、大花淫羊藿苷F等共28种。其他化学成分并未广泛分布于各药材中，具体表现为淫羊藿中未检测到新橙皮苷、2''-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、epimedokoreanoside或其异构体、淫羊藿定L、朝藿定Ⅰ 5种化合物；柔毛淫羊藿中不含有2''-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、木兰花碱及icarisoside B 3种化合物；箭叶淫羊藿中不含有2''-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、epimedokoreanoside 或其异构体、淫羊藿定L及icarisoside B 4种化合物；朝鲜淫羊藿中不含有异香草醛、2''-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、epimedokoreanoside 或其异构体、川陈皮素及icarisoside B5种化合物；而巫山淫羊藿中包含了上述全部37种化合物。在OPLS-DA分析，我们所发现的VIP＞1的12个成分包括淫羊藿定L、2''-鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ、木兰花碱、新橙皮苷、紫云英苷、epimedokoreanoside 或其异构体、宝霍苷Ⅰ、山柰苷、大黄素、朝藿定I、淫羊藿苷、朝霍定A可以作为区分不同基原淫羊藿及巫山淫羊藿的药材的指标性成分。

中医理论认为，淫羊藿能够温补肾阳、祛风湿、强筋骨。现代药理学研究表明，淫羊藿具有促进生殖系统、抗骨质疏松、抗肿瘤及抗动脉粥样硬化等作用[14-15]。Zhang等[16]的相关研究结果表明，淫羊藿苷可以通过增加睾丸、附睾的重量、指数等方式来减弱全氟辛烷磺酸（PFOS）诱导所引发的睾丸毒性；同时也可以通过减轻Sertloli细胞的连接损伤来改善PFOS诱导的血液睾丸屏障的破坏；Meng等[17]的研究结果表明，在淫羊藿粗提物中，正丁醇及乙醇部分可以对成骨细胞UMR-106有刺激增殖活性，其中淫羊藿苷、朝霍定B及朝霍定C 3种成分可以明显促进成骨细胞UMR-106的增殖。Hu等[18]的研究结果表明，淫羊藿苷可以减轻异丙肾上腺素诱导的H9c2或者NRCM心肌细胞肥大。Li等[19]的研究结果表明，淫羊藿苷可以通过MDM2-p53途径下调甲胎蛋白对肝癌细胞起到抑制作用。Tao等[20]通过实验验证了淫羊藿素对人类髓源性抑制细胞（MDSCs）的抑制作用。结合淫羊藿药材的有效化学成分，淫羊藿中的淫羊藿苷、淫羊藿素、朝霍定B等成分，可以作为控制淫羊藿药材药效的指标性化学成分。本研究发现，淫羊藿苷在柔毛淫羊藿中相对含量最高，其次为朝鲜淫羊藿，淫羊藿中所含最少；淫羊藿素在巫山淫羊藿中含量最高，其次为箭叶淫羊藿，柔毛淫羊藿中含量最少；朝霍定B在心叶淫羊藿中含量最高，其次为柔毛淫羊藿，巫山淫羊藿中含量最少。查阅相关文献报道[2]，对淫羊藿、箭叶淫羊藿及朝鲜淫羊藿3种不同基原淫羊藿药材的药效差异性进行对比分析发现，不同基原淫羊藿药材对不同指标方面的药效程度有所不同，如在肾功能指标改善作用方面，淫羊藿及朝鲜淫羊藿效果显著，但箭叶淫羊藿作用不明显；在抗氧化作用方面，淫羊藿及箭叶淫羊藿效果显著，但朝鲜淫羊藿效果不明显等。结合本试验研究结果，不同淫羊藿药材的化学成分差异可以直接影响其药效的差异。

通过本实验对不同基原淫羊藿及巫山淫羊藿的药材中所鉴定出成分的相对含量进行测定，结合相关文献，并通过数据分析软件初步探讨不同基原药材化学成分的差异性。由于淫羊藿药材分布的广泛性及其基原的复杂性，后续将继续收集多批次不同产地、不同基原的淫羊藿药材进一步验证，深入研究药材功效与化学成分之间的关系，为不同基原淫羊藿药材的鉴定、质量控制及临床上合理用药奠定基础。