辣木叶水提物对大鼠肝纤维化的改善作用及机制

杨学芳，董馨忆，普吉霞，刘建昆，马 立 ，张志毕,

（1.昆明医科大学，云南昆明 650500；2.解放军联勤保障部队第九二〇医院，云南昆明 650032；3.大理农林职业技术学院，云南大理 671003）

肝脏纤维化（Hepatic Fibrosis，HF）是一种肝脏组织无效的损伤-修复，是多种慢性肝脏疾病中后期共同的病理过程，主要的病理表现为细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）积累和瘢痕形成[1]。当肝脏受到严重破坏或持续损伤时，ECM 大量积累，纤维增生向肝实质细胞间隙延伸，并逐渐形成纤维索及纤维间隔，纤维间隔继续发展则连接形成纤维包裹[2]。HF 之前的肝脏病变都是可逆的，但是当肝脏疾病发展到肝硬化和肝癌阶段，是不可逆转的，所以在HF 阶段及时阻止并逆转肝脏疾病的发展，对于各种肝脏疾病的治疗具有重要的意义[3]。

人类机体很容易受到氧化应激的伤害，氧化应激是指机体内活性氧（ROS）积累过多，造成细胞和组织损伤的一种病理状态，ROS 诱导的细胞损伤及炎症反应，影响细胞膜和细胞器的结构，释放大量的炎症因子，导致肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells，HSC）活化、增殖和细胞外基质的合成、积累，导致HF 的形成[4]。研究发现ROS 与酒精性肝病和病毒性肝炎导致的HF 发生具有密切的关系，在HF 患者或实验性HF 模型动物的血清和肝脏组织中，都检测到高浓度的ROS 表达[5-6]。研究表明转化生长因子β1（Transforming Growth Factorβ1，TGF-β1）与ROS具有协同作用，共同介导HF 的发生。一方面TGFβ1 激活细胞膜氧化酶和促进细胞线粒体复合物IV 活性，导致细胞ROS 合成增加；另一方面，TGFβ1 抑制抗氧化还原酶的表达，降低细胞清除ROS 的能力，导致细胞内ROS 积累[7]。ROS 的积累会促进了TGF-β1 的表达，TGF-β1 与细胞膜表面受体结合后招募Smad2 和Smad3 形成蛋白复合物，Smad2/3蛋白复合物被ROS 介导的磷酸化激活后转移进入细胞核，作为转录因子与下游靶基因DNA 结合，激活a-SMA、胶原纤维等HF 基因的表达，导致HF 发生[8]，因此抗氧化是治疗HF 的重要方法。

辣木（Moringa oleiferaLam.）主要分布于我国云南、广东、福建、台湾等地[9]，2012 年，辣木叶被卫生部批准为新资源食品。辣木含有丰富的蛋白质、维生素、多糖、多酚等多种营养成份和活性物质，具有抗氧化、抑菌、降血糖、降血脂、抗肿瘤、清热解毒等功效，是一种药食同源的中草药[10-11]。研究发现辣木叶乙醇提取物具有较强的抗氧化作用[12]，对高脂饮食导致的肝损伤及高脂血症[13]、CCl4诱导的肝损伤[14]、奥氮平诱导的糖脂代谢紊乱[15]和肝癌[16]都具有一定的保护作用，其保护作用机制与抗氧化损伤、提高脂肪代谢速率和促进肝癌细胞凋亡有关，但是对辣木叶对肝纤维化是否具有改善作用缺乏目前尚无报道。

因此，本研究建立大鼠肝纤维化模型，用辣木叶水提物（LM）灌胃治疗后检测LM 对大鼠肝纤维化病理损伤、肝脏功能和氧化应激的影响，旨在探讨LM 对肝纤维化的改善作用，为辣木叶资源的开发利用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF 级雄性大鼠 60 只，6 周龄的，体重180～200 g，购买自昆明医科大学实验动物学部，动物生产使用许可证SYXK（滇）K2020-0006，本研究获得昆明医科大学实验动物伦理委员会的批准通过（批准编号：kmmu20211491）；硫代乙酰胺（纯度≥98%）Sigma 公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、羟脯胺酸（HYP）试剂盒 南京建成生物工程有限公司；PCIII、IV-C ELISA试剂盒 上海酶联生物科技有限公司；LN ELISA 试剂盒、HA ELISA 试剂盒 武汉华美生物工程有限公司；TGF-β1、α-SMA 一抗 武汉华美生物工程有限公司；Smd2 一抗、Smad3 一抗 ABclonal 公司；总RNA提取试剂盒 Axygen 公司；逆转录试剂盒 Thermo Scientific 公司；实时荧光定量PCR 试剂盒 宝生生物工程有限公司；秋水仙碱片 云南昊邦制药有限公司；辣木叶干粉 陕西泰科生物科技有限公司。

Synergy2 型多功能酶标仪 美国Biotek 公司；Centrifuge5804R 型冷冻离心机 德国Eppendorf 公司；EG1150 石蜡包埋机、RM2245 切片机、DMLIM显微镜 德国Leica 公司；GCZX3 型垂直电泳仪及转膜仪 美国BD 公司；QuantStudioTM 6 Flx 型实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）仪 美国Thermo Fisher 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 辣木叶水提取物制备 辣木叶干粉200 g，加入2 L 超纯水煮沸10 min，冷却到室温后用2 μm 滤膜过滤，溶液经5000 r/min 离心10 min 后真空冷冻干燥，得到褐绿色的辣木叶水提物粉末（LM），-20 ℃冷冻保存，每次灌胃前需用生理盐水现配为相应的浓度。

1.2.2 动物分组及处理 60 只大鼠随机分为空白组、模型组、秋水仙碱组（100 mg/kg·d）、LM 高、中、低剂量组（剂量分别为200、100、50 mg/kg·d），每组10 只，除空白组外，其余组大鼠隔天注射硫代乙酰胺（TAA，剂量160 mg/kg）1 次，共注射8 周[17]，自造模开始后的第5 周开始灌胃，药物组灌胃1 mL/kg 药物，1 次/d，空白组和模型组灌胃等量生理盐水，灌胃至第8 周结束后处死大鼠，取大鼠血清和部分肝脏-80 ℃保存，另一部分肝脏用10%甲醛溶液固定。

1.2.3 检测指标

1.2.3.1 体重和肝脏指数检测 给药处理期间每周检测1 次大鼠体重，给药结束后取大鼠肝脏，用预冷生理盐水快速清洗后滤纸吸干，称量肝脏质量，计算肝脏指数，肝脏指数=肝脏重量/大鼠体重×100。

1.2.3.2 肝脏功能、氧化应激水平和HF 指标检测大鼠血清样根据试剂盒说明书检测转氨酶ALT、AST 浓度评价肝脏功能；检测肝脏ROS、MDA 浓度和SOD 活性，评价肝脏氧化应激水平和抗氧化能力；检测血清HF 四项指标（PCIII、IV-C、LN、HA）和羟脯氨酸（HYP）浓度，评价HF 程度。

1.2.3.3 肝脏组织病理学观察 肝脏组织于甲醛固定液中固定7 d。脱水透明后石蜡包埋，切片后脱蜡、水化，然后进行Masson 染色，封片后显微镜下观察肝脏纤维化水平，根据Ishak 评分标准评估大鼠HF 程度，根据肝脏纤维化严重程度评分为0～6 分，分值越大代表纤维化程度越严重[18]。

1.2.3.4 肝脏TGF-β1/Smads 通路基因表达检测蛋白表达检测：肝脏组织约30 mg，加入蛋白裂解液后超声匀浆，冰浴裂解30 min 后12000 r/min 离心10 min，取上清用BCA 法检测蛋白浓度，10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后将蛋白质通过湿转转移到PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温2 h 封闭后加入一抗孵育过夜，清洗后加入二抗室温孵育2 h，ECL 化学放光检测蛋白表达，Image J 软件分析目的蛋白条带相对表达量。mRNA 表达检测：肝脏组织约20 mg提取总RNA，然后逆转录合成cDNA。NCBI 网站设计大鼠TGF-β1、Smad2/3、α-SAM、β-actin（内参）基因引物，并通过Blast 确定引物的特异性。根据实时荧光定量试剂盒操作说明检测目的基因mRNA表达水平。采用2-△△CT法分析每个基因mRNA 的相对表达量。引物信息见表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 Sequence of PCR primer

1.3 数据处理

数据使用GraphPad Prism 5.0 进行统计分析和绘图，数据以平均值±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析方法，P＜0.05 代表组间差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 大鼠一般情况观察

实验观察发现空白组大鼠精神状态好，毛发光泽，体重增长稳定。与空白组比较，模型组大鼠精神萎靡，毛发干枯且颜色暗淡，进食和饮水减少，行动迟缓，体重极显著降低（P＜0.01），肝脏指数极显著增加（P＜0.01），符合文献[17]报道的HF 模型特征。与模型组比较，给药后（第8 周）LM 组和秋水仙碱组大鼠精神状态均有所改善，进食和饮水量增加，毛发恢复光泽，体重均显著增加（P＜0.05，P＜0.01），肝脏指数也显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。本结果显示LM 具有改善大鼠精神状态和显著下调肝脏指数的作用，见表2。

表2 LM 对HF 大鼠体重和肝脏指数的影响Table 2 Effects of LM on body weight and liver index in HF rats

2.2 辣木叶对HF 大鼠肝脏功能的保护作用

结果见表3，与空白组比较，模型组大鼠血清AST 和ALT 浓度都显著升高（P＜0.01），表明HF 大鼠肝脏功能受到损伤。秋水仙碱是逆转肝纤维和的药物之一，陶柏楠等[19]、胥文娟等[20]研究发现秋水仙碱能够降低HF 大鼠血清ALT 和AST，改善肝脏功能，本研究也发现，秋水仙碱组大鼠血清ALT 和AST 浓度较模型组显著降低（P＜0.01），表明秋水仙碱能够改善HF 大鼠肝脏功能。与模型组比较，LM高、中、低剂量都能够显著降低HF 大鼠血清AST和ALT 浓度（P＜0.05 或P＜0.01）。本结果显示LM能够改善大鼠肝脏功能。

表3 LM 对HF 大鼠血清AST、ALT 浓度和肝纤维化评分的影响Table 3 Effects of LM on serum AST,ALT levels and liver fibrosis score in HF rats

2.3 LM 改善HF 大鼠肝纤维化病理损伤

HF 病理损伤和肝纤维化评分如图1 和表2 所示，空白组大鼠肝脏组织细胞大小均匀，排列规整，细胞形态清晰，沿中央静脉呈现放射状分布，无炎性细胞浸润，也无变形和坏死。模型组大鼠肝脏细胞排列混乱，肝细胞显著变性，肝小叶结构遭到破坏，细胞染色不均，部分细胞呈空泡样改变，外基质分泌较多，汇管区纤维增生严重，形成清晰的纤维间隔，HF 评分极显著增加（P＜0.01），表明本研究成功建立了大鼠HF模型。与模型组比较，秋水仙碱组HF 大鼠肝脏组织纤维增生显著减少，肝细胞空泡样改变得到显著缓解，炎性浸润程度降低，肝脏细胞排列相对规整，HF评分极显著降低（P＜0.01）。而LM 高剂量组大鼠肝脏组仅能观察到少量纤维增生和聚集，无肝细胞变性盒空泡样改变，HF 评分较模型组极显著降低（P＜0.01），LM 抗HF 病变的疗效和降低HF 评分较秋水仙碱组有更大程度的改善，LM 中、低剂量组也能在不同程度上缓解HF 大鼠HF 组织病变，并极显著降低HF 评分（P＜0.01）。

图1 LM 减轻HF 大鼠肝纤维化损伤（200×）Fig.1 LM attenuates liver fibrosis injury in HF rats (200×)

2.4 LM 降低HF 大鼠肝纤维化指标

肝脏细胞的炎性改变可以刺激纤维组织增生，导致血清HF 四项指标（PCIII、IV-C、LN 和HA）的异常升高，升高的幅度随着HF 的程度加重而增加，因此血清肝纤四项的浓度可以作为评价HF 程度的指标[21]。HYP 是胶原纤维的主要成分之一，当肝脏内胶原纤维异常增多时，肝脏组织中的HYP 含量也会随之升高，因此HYP 含量与HF 程度密切相关[22]。血清肝纤四项检测结果见表4，与空白组比较，模型组大鼠血清肝纤四项指标和肝脏HYP 含量都极显著高于空白组（P＜0.01），表明HF 大鼠肝纤维化病变严重。与模型组比较，秋水仙碱组肝纤四项和HYP 浓度都显著降低（P＜0.05，P＜0.01），而LM 也能够显著降低大鼠血清中肝纤四项指标和HYP 的含量（P＜0.05，P＜0.01），并且呈现剂量依赖关系。整体分析，LM 高剂量组对肝纤四项和HYP 含量的影响与秋水仙碱组相当。本结果显示LM 能够抑制大鼠HF 的发生和发展。

表4 LM 对HF 大鼠肝纤维化指标含量的影响Table 4 Effects of LM on the content of liver fibrosis markers in HF rats

2.5 LM 对肝脏组织氧化应激的影响

HF 的发生与氧化应激密切相关，课题组前期已证实LM 具有抗氧化作用[15]，LM 对HF 大鼠肝脏氧化应激影响的结果见表5，与空白组比较，模型组大鼠肝脏组织氧化应激指标ROS 和MDA 含量都极显著高于空白组（P＜0.01），抗氧化酶SOD 活力显著降低（P＜0.01），表明HF 大鼠肝脏组织处于氧化应激状态，肝脏组织抗氧化损伤能力降低。与模型组比较，LM 组大鼠肝脏组织ROS 和MDA 含量显著降低（P＜0.05，P＜0.01），肝脏SOD 活力显著增加（P＜0.05，P＜0.01），表明LM 具有抗氧化作用，可降低HF 大鼠肝脏组织的氧化应激水平。

表5 LM 对HF 大鼠肝脏组织氧化应激的影响Table 5 Effects of LM on oxidative stress in liver tissue in HF rats

2.6 LM 对肝脏TGF-β1/Smads 通路基因表达的影响

mRNA 检测结果见表6，模型组大鼠肝脏组织TGF-β1/Smads 通路基因，包括TGF-β1、Smad2、Smad3和α-SMA基因mRNA 表达较空白组都极显著增加（P＜0.01）。与模型组相比，秋水仙碱组α-SMA基因mRNA 表达极显著降低（P＜0.01），而TGF-β1、Smad2、Smad3基因mRNA 表达无明显变化；LM 高剂量组TGF-β1基因mRNA 表达显著降低（P＜0.05）；LM 高、中剂量组Smds2基因mRNA表达显著降低（P＜0.05）；LM 高、中、低剂量组Smds3和α-SMA基因mRNA 表达都显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表6 LM 对HF 大鼠肝脏TGF-β1/Smads 通路基因mRNA 表达的影响Table 6 Effects of LM on mRNA expression of TGF-β1/Smads pathway genes in the liver of HF rats

蛋白表达检测结果见图2，与空白组比较，模型组大鼠肝脏TGF-β1、Smad2、Smad3 和α-SMA基因蛋白表达都极显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，秋水仙碱组TGF-β1、Smad2、Smad3和α-SMA蛋白表达都极显著降低（P＜0.01）；LM 高、中剂量组TGF-β1、Smad2、Smad3和α-SMA蛋白表达都显著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；LM 低剂量组Smad3和α-SMA表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。基因表达检测结果显示模型组大鼠肝脏组织TGF-β1/Smads 通路被激活，肝星状细胞被活化，而LM 能够下调TGF-β1/Smads 通路表达，抑制肝星状细胞的活化。

图2 LM 对HF 大鼠肝脏TGF-β1/Smads 通路基因蛋白表达的影响Fig.2 Effects of LM on protein expression of TGF-β1/Smads pathway genes in the liver of HF rats

3 讨论与结论

HF 的发生与氧化应激和炎症损伤密切相关，TGF-β1、血小板衍生生长因子（Platelet Derived Growth Factor，PDGF）、肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）等细胞因子使静息状态的HSC 被激活，合成以α-SMA 为标志物的活化蛋白，被活化的肝星状细胞进一步转化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞在各种细胞因子、趋化因子、生长因子的作用下，不断增殖并分泌ECM[23]。此外，ROS 等刺激会导致ECM 在肝脏组织中积累，形成纤维化瘢痕，影响肝脏的正常功能。所以消除损伤因素，降低HSC 的活化和增殖，是治疗HF 的主要策略之一[24]。辣木叶富含抗氧化活性物质，因此推测其可能通过抗氧化作用清除ROS 等肝损伤因素，逆转肝纤维化。

肝毒试剂TAA 诱导大鼠肝脏发生氧化应激，TAA 处理后大鼠肝脏ROS 含量和脂质氧化产物MDA[25-26]含量都显著增加，肝脏处于氧化应激损伤状态，肝脏组织内的ALT 和AST 会释放进入血液中[27]，血清中ALT 和AST 含量可以作为评价肝脏功能的指标[28]。本研究检测也证实了TAA 诱导氧化应激损伤后，肝脏ROS 和MDA 含量都显著增加，血清ALT 和AST 浓度显著增加，大鼠肝脏功能受到损伤，而LM 能够显著的降低肝脏氧化应激状态，保护肝脏功能。

肝星状细胞被激活后，会大量合成、分泌PCIII、IV-C、LN、HA 等肝脏胶原纤维成份，这些成份血清含量可以作为评价HF 的指标[29]。HYP 是胶原蛋白中特有的氨基酸成份，肝脏组织中HYP 含量也可以评价HF 程度[30]。本研究检测了大鼠血清PCIII、IV-C、LN、HA 和肝脏HYP 含量，发现模型组大鼠上述指标都显著升高，表明TAA 处理成功诱导了大鼠HF 的发生。LM 处理后，大鼠HF 指标显著降低，表明LM 成功减缓了大鼠肝脏纤维组织沉积，该结果也通过Masson 染色的结果得到了验证。

在HF 发生过程中，ROS 能显著促进TGFβ1 的表达[31]，而TGF-β1 可通过抑制抗氧化还原酶的表达，如谷氧还原蛋白、过氧化氢（catalase，CAT）、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）等，降低细胞清除ROS 的能力，导致细胞内ROS 进一步积累。TGF-β1 与受体结合后，招募Smads 蛋白形成复合物，Smads 蛋白复合物被磷酸化后转移进入细胞核内，激活下游HF靶基因的表达，导致肝星状细胞活化标志物α-SMA 表达上调[32]、ECM 合成和分泌增加[3]。因此，TGF-β1 和ROS 协同作用，一方面促进HSC 活化和增殖，增加ECM 的合成；另一方面能够抑制与ECM 降解相关的蛋白表达，抑制ECM 的降解。本研究发现，在TAA 诱导的纤维化肝脏组织内，肝脏组织ROS 和MDA 含量显著增 加，TGF-β1/Smads 通路激活，TGF-β1 表达显著增加，其结合蛋白Smad2/3 表达也显著增加，因此ROS-TGF-β1/Smads 通路的激活是HF 发生的重要因素。而LM 处理后，大鼠肝脏组织ROS 和MDA 浓度都显著降低，TGF-β1、Smad2/3和、下游靶基因α-SMA表达都显著降低，胶原纤维含量也显著降低，表明LM 可能通过抗氧化作用提高机体清除ROS 的能力，抑制ROS-TGF-β1/Smads通路的激活，进而抑制下游肝星状细胞的活化和ECM 的合成、分泌，减轻HF 损伤。

多项研究表明，辣木叶提取物具有抗氧化、抗炎、增强免疫力等广泛的药理作用[10]，本研究结果显示LM 能够提高机体抗氧化能力，显著降低HF 大鼠肝脏ROS 含量，改善大鼠HF 损伤。作用机制研究结果显示，LM 能够显著抑制HF 大鼠肝脏TGFβ1/Smads 通路TGF-β1、Smad2/3和下游α-SMA、胶原纤维基因的表达，推测LM 可能通过调控ROSTGF-β1/Smads 通路发挥抗肝纤维化作用，但是LM改善HF 的药效物质基础还需要进一步的研究。