黑果枸杞花色苷的提取、纯化及降解动力学研究

连 敏，高艺玮，年 新，王梦泽

（宁夏大学食品科学与工程学院，宁夏银川 750021）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum）是西北地区特有的耐盐抗旱茄科枸杞[1]，属多棘刺生灌木的一种荒漠植物[2-4]。富含花色苷、多糖、维生素E、β-胡萝卜素等多种抗氧化物质，具有缓解非酒精性脂肪肝，保护皮质神经元、改善阿尔茨海默病，延缓衰老及滋补肝肾等功效[5-6]。花色苷作为黑果枸杞的主要功效成分，其含量为6.14～21.79 mg/g[7-9]，花色苷具有强抗氧化性、抑制炎症[10]、预防心血管疾病、抗肿瘤[11]、预防糖尿病和明目等功效[12-14]。

国内外对黑果枸杞花色苷的提取研究主要集中以传统干果为原料，通过溶剂[15]、微波辅助[16]、超声波辅助及超临界流体进行提取，其中溶剂提取是最常规的方法[17-19]，而在花色苷纯化及降解方面报道较少。花色苷在黑果枸杞传统干果干燥过程中氧化降解较高、活性较低[20]，且单一的溶剂提取效率低，花色苷不能完全释放、提取时间长[21]。因此，本文以冻干黑果枸杞为原料，通过单因素、正交试验得到花色苷提取最佳工艺，研究了大孔树脂对黑果枸杞花色苷静态、动态吸附解吸特性及纯化效果，并对花色苷在不同温度、pH 条件下降解动力学进行了探讨，旨在为黑果枸杞花色苷开发利用提供理论依据，促进西北优势特色植物资源高值化利用与乡村振兴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冻干黑果枸杞（以鲜果为原料）宁夏森淼科技集团；无水乙醇 分析纯，广东光华科技股份有限公司；乙酸钠、氯化钾 分析纯，上海阿拉丁生物科技股份有限公司；AB-8、D101、HDP100、X5、D130、DA201 大孔树脂 天津光复精细化工研究院。

DXF-10D 型超微粉碎机 广州市大祥电子机械设备有限公司；JA 2003 型电子分析天平 上海菁海仪器有限公司；DF-2 型磁力搅拌器 常州诺基仪器有限公司；754PC 型紫外-可见分光光度计 上海箐华科技仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 材料预处理 选取大小均一、品质优良的鲜果冻干黑果枸杞，采用超微粉碎研磨成粉，过40 目筛，-80 ℃避光保存，使用前密封恢复至室温。

1.2.2 黑果枸杞花色苷提取工艺 准确按照一定料液比称取黑果枸杞粉于锥形瓶中，以乙醇溶液为提取剂，设置超声功率300 W，在一定的超声温度下提取一定时间，得到黑果枸杞总花色苷的提取液。

1.2.3 单因素实验设计 准确称取黑果枸杞粉于锥形瓶中，采用乙醇溶液为提取剂，以黑果枸杞花色苷的含量为参考指标。以料液比1:20 g/mL、乙醇浓度60%、pH3、提取时间2 h 为固定值，研究了料液比（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25 g/mL），乙醇溶液的体积分数（20%、40%、60%、80%、90%），pH（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0），提取时间（1.5、2、2.5、3、3.5 h）。

1.2.4 正交试验 根据单因素实验结果，以黑果枸杞花色苷含量为考察指标，选取四个影响因素3 水平设计正交试验L9（34）对黑果枸杞花色苷提取工艺进行优化，正交因素水平设计如表1 所示。

表1 正交试验设计Table 1 Orthogonal experimental design

1.2.5 总花色苷提取量的测定 取0.2 mL 的提取产物，分别用pH1.0 氯化钾溶液与pH4.5 醋酸钠缓冲溶液稀释，室温避光静置适当时间，得pH1.0 和pH4.5供试品溶液，在510 nm 和700 nm 处测定吸光值，采用pH 示差法计算花色苷提取量[22]：

式中：TAC 表示总花色苷提取量（Total anthocyanin content，TAC），A（吸光值）=（Aλmax-A700nm）pH1.0-（Aλmax-A700nm）pH4.5；Mw（分子量）=449.2 g/mol，以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计；DF（稀释因子）=20；ɛ（摩尔消光系数）=26900 L/（mol·cm），以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计；L（比色皿光径长度）=1 cm；V：提取产物体积；m：提取样品质量。

1.2.6 大孔树脂吸附、解吸试验

1.2.6.1 树脂预处理 使用前，将大孔树脂用无水乙醇溶液浸泡24 h，然后用无水乙醇溶液洗涤，直至流出液清澈。之后用去离子水洗涤树脂至乙醇被取代，备用。

1.2.6.2 大孔树脂的筛选 在锥形瓶中加入经过预处理的树脂（D130、D101、HPD100、AB-8、X5、DA201）各2 g，再向其中加入50 mL 用去离子水稀释2 倍的黑果枸杞花色苷粗提液，于25 ℃、110 r/min的恒温振荡器中振荡24 h，充分吸附后，将树脂滤出，将滤出的树脂用蒸馏水冲洗后，加入20 mL 乙醇溶液（80%）置于恒温振荡器上于25 ℃、110 r/min 下振荡24 h，充分解吸后，将树脂滤出，用pH 示差法，采用以下公式计算其吸附量和解吸量[23]。

1.2.6.3 AB-8 树脂吸附上样浓度 准确称取2 g 经过处理的树脂于锥形瓶中，并向其加入同体积不同浓度的花色苷溶液（10、20、50、100、200、250 mg/100 g），于25 ℃、110 r/min 下恒温振荡3 h，测定其吸附量，吸附量最大值为AB-8 吸附的最佳上样浓度[24]。

1.2.6.4 AB-8 树脂洗脱乙醇浓度 将吸附饱和后的AB-8 大孔树脂抽滤后置于100 mL 锥形瓶中，分别用40 mL 不同浓度的乙醇溶液（50%、60%、70%、80%、90%）进行洗脱，置于恒温振荡器，于25 ℃、110 r/min 振荡24 h，充分解吸后过滤，测定其解吸量，选择最佳乙醇浓度[25]。

1.2.6.5 AB-8 树脂上样溶液流速 将2 mg/mL 花色苷溶液分别采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min 的流速等体积上样，通过测定其吸附量来选择最佳的上样花色苷浓度[26]。

1.2.6.6 AB-8 树脂上样体积的确定 以2 mg/mL花色苷溶液，上样溶液流速为2 mL/min，上样体积为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 BV 时，并分别测定其流出液吸光度值。当流出液花色苷吸光度值为上样液吸光度的1/10 时，此时树脂达到吸附饱和，溶液发生泄漏，以此确定最佳的上样体积[27]。

1.2.6.7 AB-8 树脂乙醇溶液洗脱流速 将80%的乙醇浓度分别用1、2、3、4、5 mL/min 的流速对已吸附饱和的树脂进行洗脱，每10 mL 接一次样，收集流出液及洗脱液，测定其花色苷浓度，选择最佳的洗脱流速[28]。

1.2.7 pH 和温度对黑果枸杞花色苷降解动力学的研究 分别取5 份不同pH（3、4、5、6、7）的纯化黑果枸杞花色苷溶液于离心管中密封，并将其在不同温度（40、50、60、70、80 ℃）下水浴6 h。每个1 h 取样一次，冰水浴，测定5 组花色苷含量，每组三次平行。

假定本实验中黑果枸杞花色苷的降解符合一级动力学模型。根据式（4）计算动力学参数[29]：

式中：C0为溶液的初始花色苷含量，mg/mL；C为溶液加热t时间时的花色苷含量，mg/mL；k 为降解速率，h-1；t 为加热时间，h。

当C/C0=1/2 时，花色苷残留率为50%，降解半衰期为：

采用Arrhenius 方程求得反应的活化能 Ea：

式中：k 为热降解反应常数，h-1；k0为频率常数，h-1；R 为气体常数8.314 J/（mol·K）；T 为反应温度，K；Ea为反应活化能，kJ/mol。

花色苷的Z 值和温度系数Q10计算如下：

其中：T 为温度（℃）；b 为线性方程的截距；K 为T ℃下的降解速率，h-1；T1、T2分别代表不同温度；K1、K2分别为温度为T1、T2时的反应速率常数。

通过式（9）、式（10）、式（11）计算焓变ΔH、吉布斯自由能ΔG 和熵变ΔS：

式中：h 为普朗克常数，6.6262×10-34J/s；kB为玻尔兹曼常数，1.3806×10-23J/K。

1.3 数据处理

采用Design-Expert 8.0.6 软件进行正交分析，采用数据分析软件Origin 2022 作图。每组实验重复3 次，试验结果用平均值±标准差（±s）表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比的确定 不同料液比对花色苷提取量的影响，如图1a 所示。当料液比为1:20 g/mL 时，花色苷提取量最高，为35.047±0.230 mg/g；料液比为1:5 g/mL 时，花色苷提取量最低。随着料液比的增加，黑果枸杞花色苷提取量先升高后降低，这是由于花色苷极性较强，料液比增加扩大了料液接触面积，加速花色苷的溶出。而料液比为1:10 与1:15 g/mL 时，花色苷提取量无显著差异（P＞0.05）。随着料液比的继续增加，花色苷提取量增幅减小，这是由于相同温度下，需要加热的液体量增加，因此物料加热缓慢，导致花色苷溶出缓慢，提取量降低[30]。

图1 料液比、乙醇浓度、pH 和提取时间对花色苷提取量的影响Fig.1 Effects of solid-liquid ratio,ethanol concentration,pH and extraction time on the amount of anthocyanoside

2.1.2 乙醇浓度的确定 不同乙醇浓度对花色苷提取量的影响，如图1b 所示。当乙醇浓度从20%升到80%时，花色苷的含量逐渐升高，且乙醇浓度在80%时，花色苷的含量达到最大，为35.907±0.340 mg/g；乙醇浓度从80%到90%变化时，花色苷的含量逐渐降低，这是由于乙醇浓度太高，破坏花色苷结构，导致其含量降低[22]。因此，乙醇浓度为80%为提取花色苷的最佳提取溶剂。

2.1.3 pH 的确定 不同pH 对花色苷提取量的影响，如图1c 所示。随着pH 的增大，花色苷提取量逐渐增大，pH 为3 时达到最大，为33.207±0.335 mg/g，继续增大pH，花色苷提取率反而有所降低，这是由于随着pH 的增大，花色苷稳定性降低，导致结构发生改变[31]。

2.1.4 提取时间的确定 不同提取时间对花色苷提取量的影响，如图1d 所示。随着提取时间的延长花色苷提取量先增大后减小，当提取时间为2.5 h，其花色苷的提取量达到最大，为35.637±0.316 mg/g。但随着提取时间的延长，花色苷含量降低，这是由于提取时间过长，导致花色苷氧化降解[32]，因此，2.5 h 作为最佳提取时间。

2.2 正交试验结果

2.2.1 正交设计试验结果 正交试验结果如表2 所示，极差结果表明，影响冻干黑果枸杞花色苷提取量的主次因素顺序为：乙醇浓度＞料液比＞提取时间＞pH。由表3 可知，各因素对花色苷提取量表现出极显著差异（P＜0.01），综合指标最优组合为A3B1C3D1，即最佳提取条件为料液比1:25 g/mL、乙醇浓度60%、pH4、提取时间2 h。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal test results

表3 正交试验方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal experiment

2.2.2 最优提取条件验证试验 在最优提取工艺条件为料液比1:25 g/mL、乙醇浓度60%、pH4、提取时间2 h 时进行验证试验，平行三次，得黑果枸杞中花色苷含量为36.507±0.325 mg/g，相较于正交试验中最优组合所得花色苷提取量更高，表明此条件具有可行性。

2.3 黑果枸杞花色苷的纯化

2.3.1 大孔树脂的筛选 6 种不同大孔树脂对黑果枸杞花色苷吸附量和解吸量的影响，如图2 所示，AB-8 树脂的吸附能力最好，其吸附量为26.933±0.252 mg/g，解吸量为25.200±0.316 mg/g，这是由于AB-8 树脂极性弱，与黑果枸杞花色苷结构中的弱极性基团结合能力较好[33]。因此，选择AB-8 树脂开展冻干黑果枸杞花色苷纯化试验。

2.3.2 AB-8 树脂吸附上样浓度 不同花色苷浓度对AB-8 树脂吸附花色苷的影响，如图3 所示。在一定范围内，吸附量随着花色苷浓度增大而增大，当花色苷浓度达到200 mg/100 g 后吸附量趋于稳定，这是由于上样液浓度过大，上样液会产生絮凝和沉淀，造成树脂污染和阻塞[34]，其次是花色苷浓度过大，树脂吸附饱和，多余花色苷流出[33]。因此，200 mg/100 g 是最适合动态吸附黑果枸杞花青素的样品浓度。

图3 花色苷上样浓度对吸附量的影响Fig.3 Effect of anthocyanin loading concentration on adsorption capacity

2.3.3 AB-8 树脂洗脱乙醇浓度 乙醇浓度对解吸量的影响，如图4 所示，随着乙醇浓度的提高，黑果枸杞花色苷的解吸量不断增加，当乙醇浓度为80%时，黑果枸杞花色苷的解吸量达到最大。由于洗脱液与花色苷相似相容原理，80%的乙醇极性和黑果枸杞花色苷的极性相似，吸附在AB-8 树脂上面的花色苷溶解于洗脱液中，进而被洗脱下来[35]，因此，选取浓度为80%的乙醇溶液作为解吸黑果枸杞花色苷的洗脱溶剂。

图4 乙醇浓度对解吸量的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on desorption capacity

2.3.4 动态吸附溶液上样流速的确定 上样流速对黑果枸杞花色苷吸附效果的影响如图5 所示。随着上样速度的增大，吸附量呈显著（P＜0.05）的增加趋势，当上样流速达到2 mL/min 后，吸附量有明显下降，根据实验结果最终确定上样流速为2 mL/min。上样流速是影响大孔树脂吸附效率的关键因素，若上样速度过快，会使得原花色苷吸附量减少，导致花色苷样品的浪费；若上样流速太慢，虽然可以使大孔树脂充分吸附花色苷，但是耗时较长，影响效率[36]。

图5 上样速度对AB-8 树脂吸附量的影响Fig.5 Effect of loading rate on adsorption capacity of AB-8 resin

2.3.5 上样体积的确定 上样体积对吸附量的影响，如图6 所示。随着上样体积的增加，流出液吸光度值呈增加的趋势，当流出液体积为10 BV 时AB-8大孔树脂对花色苷的吸附基本达到饱和。当上样体积为5 BV 时，吸光度值为上样液吸光度的1/10，认为此时为泄漏点。

图6 吸附泄露曲线Fig.6 Adsorption leakage curve

2.3.6 动态洗脱流速的确定 洗脱流速对解吸量的影响，如图7 所示，当解吸流速为1 mL/min 时，AB-8大孔树脂对黑果枸杞花色苷的解吸量为24.200±0.400 mg/g，洗脱流速为2 mL/min 时解吸量为24.933±0.321 mg/g。考虑到洗脱流速越小，效率降低，因此，选择洗脱流速为2 mL/min。

图7 洗脱流速对解吸量的影响Fig.7 Effect of elution velocity on desorption

2.4 不同pH 和温度下黑果枸杞花色苷降解动力学

由式（4）计算在不同pH 和温度下黑果枸杞花色苷的降解速率，并进行线性回归，结果见表4。结果表明，不同pH 和温度下，纯化后黑果枸杞花色苷的降解符合一级动力学反应模型（R2＞0.96）。

表4 黑果枸杞花色苷在不同pH 和温度下的动力学参数Table 4 Kinetic parameters of anthocyanins in Lycium barbarum at different pH and temperature

如表4 显示，相同pH 下，随着温度的升高黑果枸杞花色苷的降解速率常数k 增大，半衰期t1/2随着温度的升高而降低，花色苷稳定性降低。说明在一定范围内，温度越低，花色苷结构越稳定。相同温度条件下，花色苷的降解速率随pH 的增大而加快，pH3.0 时，黑果枸杞花色苷活化能Ea最小，Z 值最大，说明其降解所需能量最大，花色苷最稳定。

温度系数Q10结果表明，pH3.0 时，Q10随着温度的升高而增加，这是由于高温促进了花色苷的降解速率，在pH4.0～7.0 时，Q10随着温度的升高而降低，这是弱酸或中性条件下，由于花色苷结构发生改变，导致其热稳定性改变[37]。在黑果枸杞加工时，尽可能避免高温处理。

黑果枸杞花色苷在不同pH 和温度下的热力学参数，如表5 所示，ΔH 代表反应前后的能量势垒。ΔH 表明花色苷降解反应均为吸热反应，高温提供了更多花色苷降解所需的能量，活化络合物的形成加快，使得达到能量屏障所需的时间减少[38]。相同pH 下，黑果枸杞花色苷热降解的ΔH 相似，这表明在一定范围内的温度变化不影响黑果枸杞花色苷降解的能量势垒。pH 为3 时，ΔH 最大，说明花色苷最稳定。

表5 黑果枸杞花色苷在不同pH 和温度下的热力学参数Table 5 Thermodynamic parameters of anthocyanins in Lycium barbarum at different pH and temperature

纯化后，黑果枸杞花色苷热降解的ΔG 在同一pH 不同温度下变化不大（95.83～106.94 kJ/mol），这表明花色苷热降解是非自发的。

ΔS 反映体系中分子的无序化，在同一pH 环境下，ΔS 变化范围极为接近，说明温度对花色苷降解的ΔS 影响较小。pH 为3 时，ΔS 的绝对值的变化范围明显低于pH 为5 时的值，说明pH 为3 时，黑果枸杞花色苷最不易被降解。

3 结论

本文以冻干黑果枸杞为原料，确定了黑果枸杞花色苷最佳提取、分离纯化工艺，并研究了花色苷降解动力学。最佳提取工艺为料液比1:25（g/mL）、乙醇浓度60%、pH4、提取时间2 h，在此条件下，提取量高达36.507±0.325 mg/g；AB-8 型大孔树脂纯化黑果枸杞花色苷效果最好最佳工艺参数为上样液浓度为200 mg/100 g，上样流速为2 mL/min，洗脱流速为2 mL/min，上样体积为5 BV；降解动力学结果表明：黑果枸杞花色苷的热降解符合一级动力学模型，不同pH 下黑果枸杞花色苷热稳定性不同，随pH 的降低，其稳定性加强。本研究在后续将对黑果枸杞花色苷组分进行定性和定量分析，探索花色苷降解主要组分，通过研究多糖、蛋白等大分子与花色苷单组分的相互作用，以提高花色苷稳定性，为黑果枸杞花色苷深度开发与应用奠定了理论与技术基础。