气相色谱法测定鱼肉中指示性多氯联苯的不确定度评定

杨冉冉，左惠君，王忠一，都 芸，鲍治成，周雁楠，王开宇

（烟台市食品药品检验检测中心，山东烟台 264000）

多氯联苯（Polychlorinated biphenyls，PCBs）分子通式为：C12Hn+mCl10-n-m，其中n，m=0～5，是最具代表性的一类持久性有机污染物，拥有209 个同系物和异构体[1-3]，已于2001 年被列入联合国环境规划署12 种持久性有机污染物之列[4-5]。PCBs 具有难降解性、远距离迁移性、生物蓄积性、致癌、致畸、致突变等特性，对人类健康产生极大的危害[6-8]。近年来，我国对水产动物及其制品中关于多氯联苯的限量要求更加严格[9-10]，因此对检测方法的准确度提出了更高的要求。不确定度是与测量结果联系紧密的参数，是判定测量结果准确度的重要依据[11-14]。为了检验结果具有更高的可信度，对不确定度的评定受到各行业的关注[15-17]。

目前，有一些评定多氯联苯测量不确定度的示例[18-21]。但存在以下不足：未能正确识别出“被测量”，仅评定多氯联苯中一种成分的测量不确定度，而不是样品中7 种多氯联苯成分含量之和的不确定度；能识别出正确的“被测量”，但未能根据测量标准建立正确的测量模型，仅分别评定7 种成分单独含量的测量不确定度，然后将7 种成分的不确定度简单合成；未考虑内标定量方法的特点，未能正确分析内标法测量的不确定度分量。

现以鱼肉质控样品为例，根据内标定量方法的特点，按照JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[22]重新建立多氯联苯测量模型，评定多氯联苯含量（以PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153 和PCB180 总和计）的测量不确定度。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱼肉质控样品（肉泥状）购买于广州谱恩公司；正己烷、二氯甲烷 农残级，Honeywell 公司；浓硫酸优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；碱性氧化铝固相萃取柱 深圳逗点生物技术有限公司；PCBs 混合标准品（10 μg/mL）CATO 公司；PCB198标准品（99 μg/mL）BePure 公司。

气相色谱仪（配电子捕获检测器及Open LAB CDS 数据处理系统）美国安捷伦公司；SHAIII/C 型水浴恒温振荡器 北京况胜实业发展有限公司；SF-FDL-550 型离心机 上海菲恰尔分析仪器有限公司；Multi Reax 型多位试管涡旋振荡器 德国heidolph 公司；R300 型旋转蒸发仪 步琦实验室设备贸易（上海）有限公司；N-EVAP112（8125）型氮吹仪 美国Organomation 公司；BSA223S-CW 型电子天平 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

1.2 实验方法

依据方法GB 5009.190-2014《食品安全国家标准食品中指示性多氯联苯的测定》中第二法气相色谱法[23]。原理为在试样中加入PCB198 内标，水浴加热振荡提取后，经硫酸处理、色谱柱层析净化后，采用气相色谱-电子捕获检测器法测定。根据GB 2762-2022《食品安全国家标准食品中污染物限量》，多氯联苯含量以PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153 和PCB180 总和计。

1.2.1 标准溶液配制

1.2.1.1 多氯联苯混合标准中间液 准确移取1.0 mL多氯联苯混合标准品于25 mL 容量瓶中，正己烷定容至刻度，即得浓度为400 μg/L 的多氯联苯混合标准中间液。

1.2.1.2 多氯联苯内标（PCB198）中间液 移取1.0 mL PCB198 标准品于25 mL 容量瓶中，正己烷定容至刻度，即得浓度为396 μg/L 多氯联苯内标中间液。

1.2.1.3 多氯联苯混合标准溶液系列 分别准确移取12.5、50、100、250、500 μL 多氯联苯混合标准中间液于气相进样瓶中，加入100 μL 浓度为396 μg/L的PCB198 内标中间液，加正己烷补至1 mL，混匀，即得PCBs 浓度分别为5、20、40、100、200 μg/L，内标浓度为39.6 μg/L 的系列标准溶液。

1.2.2 样品处理 准确称取5.0 g 试样，加入100 μL内标中间液，加入30 mL 二氯甲烷＋正己烷（50+50）溶液振摇，于恒温水浴振荡仪中振荡。离心取上清液，残渣加3×10 mL 的正己烷，振荡后离心取上清液。合并上清液于茄形瓶中，旋转蒸发至近干。将浓缩的提取液转移至10 mL 试管中，用约5 mL 正己烷洗涤茄形瓶3～4 次，洗液并入浓缩液中，正己烷定容至10 mL，并加入1 mL 浓硫酸，振摇1 min，以3000 r/min 的转速离心5 min，使硫酸层与有机层分离。重复操作，直至上层溶液呈无色。15 mL 正己烷预淋洗碱性氧化铝固相萃取柱。将上清液转移至小柱上，当液面降至无水硫酸钠层时，加入30 mL 正己烷（3×10 mL）洗脱；当液面降至无水硫酸钠层时，用25 mL 二氯甲烷+正己烷（5+95）分三次洗脱。洗脱液旋转蒸发浓缩至近干。将上述试样溶液转移至进样瓶中，用少量正己烷洗茄形瓶3～4 次，洗液并入进样瓶中，定容至1 mL，待GC 分析。

1.2.3 多氯联苯的上机测定 色谱柱：Agilent HP-5（30 m×0.320 mm，0.25 μm）；升温程序：120 ℃，保持3 min；15 ℃/min 升至160 ℃，保持5 min；2.5 ℃/min 升至220 ℃，保持1 min；20 ℃/min 升至270 ℃，保持5 min；进样量：1 μL；模式：不分流；进样口温度：280 ℃；检测器温度：300 ℃；流速：1.5 mL/min。

气相色谱稳定后，混合标准溶液系列和样品溶液进样检测，每份溶液进样1 次。保留时间定性，内标—标准曲线法定量。

2 结果与分析

2.1 样品测量结果

样品溶液目标物浓度采用标准曲线—内标法定量。用安捷伦Open LAB CDS 软件分析检测数据，输入多氯联苯系列标准溶液目标物浓度及内标浓度，软件根据目标物和内标峰面积检测数据及输入的目标物浓度和内标浓度自动计算标准曲线；输入样品溶液中内标浓度，软件根据样品峰面积检测数据和内标浓度，用标准曲线直接计算出样品溶液中目标物的浓度，目标物浓度测量结果见表1。根据式（1）、式（2）计算各样品中多氯联苯含量，结果见表1 。

表1 样品测量结果Table 1 Results of sample measurement

式中，cj为样品溶液中某一种目标物浓度，μg/L；V 为样品处理定容体积，mL；m 为样品质量，g；Xj为样品中某一种目标物含量，μg/kg；XPCBs为样品中七种多氯联苯含量，μg/kg。

2.2 测量模型和不确定度分析

2.2.1 建立测量数据 式（1）、式（2）并不是多氯联苯（以PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153 和PCB180 含量之和计）的测量模型，不能据此评定多氯联苯含量的不确定度。

根据内标定量法原理，样品溶液目标物浓度：

代入式（2）得：

简化得：

式（4）为多氯联苯（以PCB28、PCB52、PCB 101、PCB118、PCB138、PCB153、PCB180 含量之和计）的测量模型。

式中：ci：样品溶液中内标浓度，μg/L；cjR：样品溶液中目标物浓度与内标浓度比值，无单位，根据标准曲线校正；∑cjR：样品溶液中7 种目标物浓度比值之和，无单位。

2.2.2 测量不确定度分析 根据内标法校正原理，系列标准溶液和样品中加入同一份内标中间液，样品测量结果与样品定容体积V 无关；与内标中间液浓度无关，但与加入样品中的内标中间液体积Vi有关，则不确定度的模型为：

其中，∑cjR做为测量模型中一个独立的乘积因子，由7 种目标物浓度比值的不确定度合成；每种目标物浓度比值由目标物标准溶液不确定度和标准曲线拟合不确定度引入。根据内标法校正原理，由标准溶液系列引入的不确定度也与标准溶液定容体积及内标中间液浓度无关，无须评定其不确定度，但要评定加入内标中间液体积不确定度。按照JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》要求，鱼肉中多氯联苯测量不确定度因果图见图1。

图1 多氯联苯含量总和测量不确定度因果图Fig.1 Causal graph of uncertainty in the measurement of the sum of PCBS

2.3 测量不确定度评定

根据测量模型式（4）及不确定度模型式（5），需要根据标准曲线、样品溶液峰面积比值计算出样品溶液中目标物浓度与内标浓度的比值。样品溶液中各目标物与内标浓度之比值见表2。根据式（4）计算样品中多氯联苯含量，及相关数据平均值，计算结果见表2。

表2 样品测试液中目标物浓度与内标浓度比值及多氯联苯含量计算结果Table 2 Ratio of target concentration to internal standard concentration and the calculation of PCBS content in sample test solution

2.3.1 测量重复性不确定度 测量重复性不确定度是测量结果平均值的标准偏差，采用A 类评定，为A 类标准不确定度[24]。根据表2，6 次测量的标准偏差：

A 类标准不确定度：

A 类相对标准不确定度：

2.3.2 样品质量不确定度 样品质量m=4.793 g，使用0.001 g 电子天平。天平检定合格，检定证书显示天平示值误差E=3 mg，重复性m重=2 mg 天平分辩率d=1 mg。质量称量两次，因质量较小，质量不确定度仅由天平重复性引入[25]。根据JJG 1036-2008《电子天平检定规程》[26]，天平重复性为6 次检定称量质量的极差，按极差法求得重复性标准偏差，6 次极差系数C=2.53，则称量质量m 的不确定度：

相对不确定度：

2.3.3 样品中加入内标使用液体积Vi的不确定度样品和标准溶液中加入同一份内标中间液，同一支移液枪吸取相同体积100 μL，内标中间液体积不确定度由移液枪测量重复性引入，与移液枪容量允差无关。实验室温度在22～23 ℃，温度较为稳定，可忽略温度波动引入的不确定度。查移液枪检定证书，100 μL 测量重复性为0.2%，可直接引用，ur（Vi）=ur（Vsi）=0.2%=0.002。

2.3.4 样品溶液中7 种目标物浓度比值之和 ∑cjR的不确定度 ∑ cjR做为乘积测量模型（4）、（5）中一个因子，需要单独评定其相对不确定度。∑ cjR是样品溶液中7 种目标物浓度与内标浓度比值的总和；每种目标物浓度比值不确定度由目标物标准溶液不确定度和标准曲线拟合不确定度引入。

2.3.4.1 多氯联苯中间液（cS中=400 μg/L）的不确定度 量取1.00 mL 多氯联苯储备液，正己烷定容于25 mL，制得浓度为400 μg/L 的多氯联苯混合标准中间液。不确定度由储备液、量取体积、定容体积引入。

a.查标准品证书得PCBs 混合标准品相对扩展不确定度为±3%（k=2），相对不确定度为：

b.吸取多氯联苯储备液体积

1 mL A 级单标吸量管容量允差为±0.007 mL[27]，按三角分布k 为计算得不确定度为：

标准储备溶液20 ℃定标，溶剂异辛烷膨胀系数为β=1.14×10-3[2]，实验室温度在22～23 ℃，温度差异以最大值3 ℃计，按均匀分布假设，，则温度引入的不确定度为：

合成得：

c.定容于A 级25 mL 容量瓶，容量允差为±0.03 mL，按三角分布k 为计算得相对不确定度：

d.合成得多氯联苯中间液（CS中=400μg/L）的相对不确定度：

2.3.4.2 多氯联苯混合标准溶液系列的不确定度多氯联苯混合标准溶液系列配制由多氯联苯标准中间液及吸取体积，内标中间液及吸取体积以及定容体积决定。不确定度由多氯联苯标准中间液浓度及吸取体积、吸取内标中间液体积引入，与定容体积和内标中间液浓度无关。

a.吸取体积用100 μL/500 μL 移液枪，体积不确定度由允差和温度引入。查检定证书，吸取体积12.5 μL 时容量允差为0.9%，吸取体积50 μL 时容量允差为0.6%，吸取体积100 μL 时容量允差为0.3%，吸取体积200 μL 时容量允差为0.3%，吸取体积500 μL 时容量允差为±0.2%。按均匀分布处理为容量允差的不确定度：

温度不确定度，配制标准溶液系列与配制中间液温度基本相同，温度不确定度仅由移液枪体胀系数[28]引入，代入如下：

b.吸取内标中间液体积不确定度，同2.3.3。

c.系列标液各浓度比值的相对不确定度：

根据移液枪检定证书和使用体积，计算各吸取体积的不确定度和各浓度比值的相对不确定度，结果见表3。

表3 混合标准系列溶液的不确定度评定Table 3 Uncertainty of mixed standard series solution

d.标准溶液系列相对不确定度以各浓度比值相对不确定度的均方根表示：

7 种多氯联苯目标物浓度比值的相对不确定度相同。

2.3.4.3 标准曲线拟合引入的不确定度 标准曲线的残留偏差结果见表4，计算方式如下：

表4 标准溶液系列测量数据Table 4 Standard solution series measurement data

曲线拟合引入的不确定度：

式中：SR：标准曲线的残留偏差；a：标准曲线的斜率；P：样品溶液的测量次数，P=1；N：标准溶液总测量次数，N=5×1=5；：浓度比值平均值，：各浓度比值与均值差的平方和，

以PCB28 为例：CR28=2.248，代入式（10）得：

根据样品溶液中各目标物浓度比值评定其由标准曲线拟合引入的不确定度，结果见表5。

表5 样品溶液中各目标物浓度比值不确定度Table 5 Uncertainty of concentration ratio of each target in sample solution

2.3.5 评定样品溶液中7 种目标物浓度比值之和∑cjR的不确定度

2.3.5.1 样品溶液中各目标物浓度比值不确定度由标准溶液系列和曲线拟合合成，见表5。其中标准溶液系列引入的不确定度由样品溶液中各目标物浓度比值与标准系列相对不确定度相乘得到。

2.3.5.2 评定样品溶液中7 种目标物浓度比值之和的不确定度

相对不确定度：

2.4 回收率的不确定度

2.5 合成标准不确定度

根据评定过程可知，测量重复性、样品的称量质量、内标的加入体积、样品溶液中各目标物浓度比值之和四部分互相独立，因此合成相对不确定如下：

2.6 扩展不确定度及报告

取包含因子k=2，相对扩展不确定度Ur=k×ur=2×0.0147=0.0294≈2.9%鱼肉中多氯联苯（以PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB138、PCB153 和PCB180 总和计）报告：149.1（1±2.9%）μg/kg，k=2，式中正负号后的数为相对扩展不确定度Ur的值。

各类相对不确定度主要分量及贡献见表6。由表可知，不确定度主要来源于测量重复性和样品溶液中各目标物浓度比值之和。

表6 各类相对不确定度主要分量及贡献Table 6 Major components and contributions of various relative uncertainties

3 结论

内标法是将一定重量的纯物质作为内标加到一定量的被分析混合物中，根据测试液和内标的含量比及其相应的峰面积面积比来计算被测试组分的含量，可以有效消除由于操作条件影响而产生的实验误差[30]，准确度和精密度均优于外标法[31]。本评定示例，根据内标法的特点，没有评定内标物的浓度以及加入内标后的定容体积等引入的不确定度，仅评定加入内标体积重复性的不确定度。建立了气相色谱标准曲线—内标法测定多个目标物之和的不确定度评定的分析方法，具有科学合理、易于评定的特点。通过评定可知，根据GB 5009.190-2014《食品安全国家标准 食品中指示性多氯联苯的测定》第二法气相色谱法测量鱼肉样品中指示性多氯联苯的含量，不确定度主要来源于测量重复性和样品溶液中各目标物浓度比值之和，在以后的实验中，为了得到更加精确、可信的结果，应该根据需要经常维护保养气相色谱仪使仪器保持在最佳状态，增加平行进样次数以及在实验过程中严格按照标准规范操作。