微量QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法检测凉茶中59 种非法添加化学药物

戴尽波，沈 洁，董文静，何啸峰，聂荣荣，梁沁娴，叶彩平

（梅州市食品药品监督检验所，广东梅州 514071）

凉茶是最独特的饮料之一，是岭南人民根据当地的气候和水土特性，由清热消暑、祛湿解毒的中草药熬制而成，含有黄酮、有机酸、多糖、生物碱等各种生物活性物质，具有抗菌、消炎、抗病毒和增强免疫力的药效[1-3]。发展至今，广东凉茶已经成为岭南中医药文化的一个重要分支，代表了一种中国独有的防病养生文化，2006 年5 月，经国务院批准，广东凉茶被列入第一批国家级非物质文化遗产。近年来，有些商家为提高凉茶疗效，吸引回头客、牟取暴利，非法往凉茶里添加化学药品，部分市区开展的食品安全专项行动中也有发现多家凉茶商铺存在非法添加西药的情况[4-6]，消费者长期饮用含化学药品的凉茶，可能会出现重复或过量用药的情况，易发生严重的药品不良反应。

目前，针对凉茶非法添加药物的检测方法主要有免疫层析法[7-9]、高效液相色谱法[10-13]、液相色谱-串联质谱法[14-17]，超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术[18-20]等。免疫层析法假阳性率高、检测成分单一，而液相色谱法灵敏度、准确度较低。超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术由于设备昂贵、维护成本高，不适合大规模推广应用。液相色谱-串联质谱法因具有高通量、高灵敏度、高准确度、抗干扰强的优点，是目前凉茶非法添加药物检测的主流手段。胡佳哲等[14]报道了HPLC-MS/MS 同时测定凉茶中磺胺甲恶唑、马来酸氯苯那敏等19 种非法添加药物的方法，结果表明，所建立的方法可以用于凉茶等植物型饮料中非法添加化学药物的快速测定。张科明等[21]建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS 方法，用于分析凉茶中非法添加的10 种止咳平喘类化学药物，结果表明该方法操作简单、灵敏度高、可用于凉茶中10 种非法添加的止咳平喘类化学药物的快速分析。

凉茶一般为一种或多种中草药的水溶液提取物，成分复杂，含有大量的亲水性多糖、有机酸、蛋白质以及生物碱等，针对复杂基质，目前处理方法主要有QuEChERS 法[22-24]、固相萃取法[25-26]。QuECh-ERS（quick,easy,cheap,effective,rugged,safe）是一种高效的前处理技术。此技术在检测目标物具有灵敏度高、快速、回收率高且具有多残留检测的能力，被广泛应用于食品安全、环境检测及生物检测等领域[27-29]，目前，QuEChERS 技术在凉茶非法添加检测方面均采用常规QuEChERS，用5～10 mL 的萃取溶剂，如乙腈去萃取5～10 mL 的样品，取净化后5～20 μL 的上清液进行仪器分析，而基于质谱的分析方法所使用的上样量很小，大部分的样品提取液被浪费，既不环保也不经济。微量QuEChERS（micro-QuEChERS）技术为小型化的QuEChERS 方法，与传统QuEChERS 相比，该方法产生使用较少的溶剂、样品、吸水剂和吸附剂量，节约了分析成本，其检测更快，并达到与QuEChERS 相当的灵敏度[30-31]，且产生的废液量小。本研究基于micro-QuEChERS 前处理技术建立同时检测凉茶中59 非法添加药物的UPLC-MS-MS 方法，可实现目标物的准确定性和定量分析，满足市售实际样品的检测需求。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

20 批次的凉茶样品 均为梅州本地市售凉茶；液体混标：大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚、甲基苯丙胺混标（4 种）、磺胺类混标（18 种）、喹诺酮类混标（10 种）、四环素类混标（4 种）、酰胺醇类混标（3 种）、硝基咪唑类混标（2 种）、罂粟碱类混标（5 种）

纯度≥97%，浓度均为100 μg/mL，天津阿尔塔科技有限公司；固体单标：对乙酰氨基酚、美洛昔康、氯苯那敏、地塞米松、保泰松、特拉唑嗪、吡罗昔康、2-甲基-5 硝基咪唑、氨基比林、地西泮、萘普生、双氯芬酸钠、布洛芬 纯度≥97%，中国药品生物制品检定所；甲醇、乙腈、甲酸、氨水 色谱纯，美国ACS恩科化学；氯化钠、无水硫酸钠、无水硫酸镁 分析纯，上海国药集团；活性炭、C18、PSA 天津博纳艾杰尔科技有限公司；Z-Sep+美国Supelco 公司；多壁碳纳米管 南京先丰纳米科技公司。

AB Sciex 3500 型三重四极杆液质联用仪 美国SCIEX 公司；AUW220 型电子分析天平 岛津企业管理有限公司；Thermo ST16R 型高速冷冻离心机 美国Thermo Fisher 公司；UC-7100S 型数控超声波清洗器 美瑞泰克科技有限公司；S25 型旋涡混匀器 德国IKA 公司；Milli Q 型超纯水系统 美国Millipore 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

1.2.1.1 13 种混合标准储备液制备 分别精密称取对乙酰氨基酚、美洛昔康、氯苯那敏、地塞米松、保泰松、特拉唑嗪、吡罗昔康、2-甲基-5 硝基咪唑、氨基比林、地西泮、萘普生、双氯芬酸钠、布洛芬固体标准品0.01 g 用乙腈溶解并定容至100 mL，得到浓度为100 μg/mL 的13 种混合标准储备液，-18 ℃冰箱中避光保存。

1.2.1.2 混合标准工作液制备 分别吸取浓度为100 μg/mL 大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚、甲基苯丙胺混标（4 种）、磺胺类混标（18 种）、喹诺酮类混标（10 种）、四环素类混标（4 种）、酰胺醇类混标（3 种）、硝基咪唑类混标（2 种）、罂粟碱类混标（5 种）和13 种混合标准储备液各1.0 mL，用乙腈定容至10 mL，配成浓度为10 μg/mL 的59 种混合标准工作液，-18 ℃冰箱中避光保存。

1.2.2 micro-QuEChERS 前处理过程 准确量取1.0 mL 的样品于10 mL 离心管中，加入1.0 mL 乙腈，混匀，超声提取5 min，随后加入盐包（含0.4 g 无水Na2SO4及0.1 g NaCl），涡旋混匀1 min，4 ℃下10000 r/min 离心5 min。准确取1.0 mL 上清液至2 mL 净化管（含80 mg C18、150 mg 无水Na2SO4），涡旋混合30 s，5000 r/min 离心5 min，上清液经0.22 μm 有机滤膜过滤后，待测。

1.2.3 液相色谱条件 色谱柱：ACQUITY HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速0.2 mL/min；柱温40 ℃；流动相：A 为乙腈：甲醇（8:2），B 为0.01%甲酸水；梯度洗脱条件：0～0.5 min 95% A，0.5～2.0 min 95%～85% A，2.0～6.0 min 85%～68% A，6.0～7.5 min 68%～8% A，7.5～12.0 min 8%～3% A，12.0～14.0 min 3% A；14.0～14.1 min 3%～95%；14.0～16.0 min 95%A；进样量5 μL。

1.2.4 质谱条件 离子源：ESI 源，正/负离子模式；离子源参数：IS 电压：5500 V/-4500 V，气帘气CUR：30 psi，雾化气GS1：50 psi，辅助气GS2：60 psi，源温度TEM：550 ℃，碰撞气CAD：7 psi。

1.3 数据处理

采用AB Sciex Analyst 软件完成数据的采集，AB Sciex OS 软件完成数据处理。平行及精密度数据采用Microsoft Excel 进行计算，采用Origin 8.0 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 仪器条件优化

2.1.1 质谱参数优化 质谱参数优化采用针泵连续进样的方式，分别将1 μg/mL 的59 种化合物标准溶液分别在正、负离子模式下对各待测化合物进行全扫描，确定合适的电离方式和准分子离子，再对相应的准分子离子进行二级质谱扫描，每种化合物选择信号高、干扰小的两个离子对作为定性与定量离子，通过优化去簇电压（DP）、碰撞能量（CE），使特征碎片离子信号达到最大，优化的质谱条件见表1。

表1 59 种化合物质谱参数Table 1 Mass spectrometric (MS) parameters for detection of 59 analytes

2.1.2 色谱条件优化 本实验检测对象有59 种化合物，化学性质差异较大，同时含有5 组11 种化合物是同分异构体（磺胺二甲异嘧啶和磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪和磺胺对甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶和磺胺邻二甲氧嘧啶、四环素和多西环素、大麻二酚和四氢大麻酚），同分异构体具有相同的母离子，色谱峰需要达到完全分离，才能进行准确定量。因此，实验针对色谱柱类型和流动相成分进行优化。

2.1.2.1 色谱柱优化 分别考察了EclipseXDB-C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）、Kinetex F5（50 mm×3.0 mm，2.6 μm）、Shim-pack GIST-HP C18（100 mm×2.1 mm，3 μm）、ACQUITY HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）4 种型号的色谱柱对59 种目标化合物的分离效果，结果发现使用ACQUITY HSS T3 色谱柱时，各目标组分具有较好分离效果，特别是5 对同分异构体能够完全分离、且峰形尖锐，结果见图1，最终选择采用ACQUITY HSS T3 色谱柱进行分离。

图1 5 组同分异构体和59 种化合物总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of five groups of isomers and analytes

2.1.2.2 流动相优化 考虑到本研究中磺胺类、喹诺酮类、四环素类化合物占比较多，参考国家标准GB 31658.17[32]方法选择乙腈:甲醇（8:2）作为优化条件之一，并与纯甲醇、纯乙腈有机流动相进行比较，通过比较发现，纯甲醇作为有机相时，甲硝唑、罂粟碱等化合物峰形毛刺多、分叉，出现前沿峰，且梯度运行时间长；纯乙腈作为有机相时，喹诺酮类、四环素类化合物峰形毛刺多、不对称，磺胺类同分异构体分离度较差，甲硝唑等硝基咪唑类保留差，有杂峰，灵敏度差；乙腈:甲醇（8:2）作为有机相时化合物峰型较窄、分离度好、灵敏度高、在16 min 化合物能够完全分离。

电喷雾离子源正离子模式下，流动相中添加适量甲酸可增强目标分析物离子化效率，提高灵敏度，本实验大部分化合物均为正离子模式，但也有9 种化合物采用负离子模式，因此对浓度为0、0.005%、0.01%、0.02%、0.05%、0.1%的甲酸水进行实验，实验发现甲酸浓度超过0.01%时，负离子模式的化合物色谱峰响应值下降明显，灵敏度不能满足检测需求；当浓度低于0.01%时，正离子模式的灵敏度较低，且峰形较差；甲酸浓度为0.01%时，大部分化合物峰形尖锐，灵敏度较高，能够满足检测需求，实验最终选择0.01%甲酸水-乙腈:甲醇（8:2）作为流动相，该条件下59 种化学药物的分离效果好、各化合物灵敏度和和峰形均可满足检测要求。

2.2 Micro-QuEChERS 条件优化

2.2.1 盐析试剂优化 QuEChERS 前处理方法常用Na2SO4、MgSO4作为脱水剂、NaCl 作为盐析剂，NaCl 能够促进样品中水的析出，提高脱水剂效率，从而提高提取效率，实验分别对比了NaCl 和Na2SO4、NaCl 和MgSO4对目标化合物回收率的影响。取1 mL 样品，按样品量:乙腈:NaCl:除水剂比率1.0:1.0:0.1:0.4（v/v/w/w），添加乙腈、NaCl、Na2SO4或MgSO4。当选用MgSO4作为脱水剂时，喹诺酮类和四环素类化合物的回收率明显降低，最高降低幅度达到80%。因为喹诺酮类和四环素类药物易与Mg2+形成螯合物导致溶解度降低[33]。当选用Na2SO4作为脱水剂时，喹诺酮、四环素回收率明显提高，其余化合物的回收率变化不大，因此本实验选用NaCl 作为盐析剂、Na2SO4作为脱水剂。

2.2.2 样品体积优化 传统QuEChERS 方法中样品取样量通常为10 g 或10 mL，为考察样品量对目标化合物提取效果影响，实验测试了1.0、2.0、4.0、10.0 mL 取样量时目标化合物回收率。实验中按凉茶样品量:乙腈:NaCl:Na2SO4比率1.0:1.0:0.1:0.4（v/v/w/w），添加提取试剂、脱水剂、盐析剂，通过加标回收率进行评价。实验结果显示（图2）1.0、2.0、4.0、10.0 mL 凉茶样品量的对应59 种化合物回收率分别为47.7%～124.0%、48.5%～125.4%、44.9%～126.7%、41.0%～128.3%，RSD 小于18.2%，实验结果表明样品量减少不会影响提取回收率，最终选择样品量为1 mL。

图2 不同样品体积对59 种化合物回收率影响Fig.2 Effects of different sample amount on the recoveries of 59 analytes

2.2.3 净化材料优化 根据凉茶基质的特点，实验首先考察了C18、PSA、Z-Sep+、GCB、MWCNTs 吸附剂的净化效果，结果见图3。当各吸附剂用量为50 mg 时，从回收率角度看，C18吸附剂效果最好，回收率在53%～126.0%，平均回收率为71.6%；Z-Sep+回收率在33.0%～131.9%，平均回收率为67.5%，其中回收率＜60%有32 种，特别是对萘普生、双氯芬酸钠、布洛芬等化合物有吸附作用，回收率较低；PSA 对喹诺酮类、磺胺类、萘普生、布洛芬等带有羧基化合物具有较强吸附作用，回收率在24.1%～138.0%，平均回收率为56.3%；GCB、MWCNTs 具有较强的吸附能力，能很好的去除凉茶中色素，但对喹诺酮类、磺胺类、大麻酚等吸附作用强，平均回收率均在50%以下。故最终选择C18作为净化吸附剂，并对净化吸附剂C18的用量进行优化，当其用量为80 mg 时，59 种化合物回收率最佳，回收率在60%～120%范围内的化合物个数占84.7%，最终确定C18用量为80 mg。

图3 不同吸附剂对59 种回收率影响Fig.3 Effect of different sorbent on the recoveries of 59 analytes

2.3 基质效应研究

基质效应（Matrix effect，ME）是指样品中除检测目标分析物之外的其他成分对分析过程造成的干扰和影响。基质效应可以通过基质标准曲线与纯溶剂标准曲线的斜率之比来评价。ME＜0.8 时，表示存在基质抑制效应；0.8≤ME≤1.2 时，表示基质效应不明显；ME＞1.2 时，表示存在基质增强效应[34-35]。实验考察了59 种化合物在凉茶中的基质效应，实验结果表明，17%化合物的ME＜0.8，表现为基质抑制效应；64%化合物的ME 为0.8～1.2，基质效应不明显；19%药物的ME＞1.2，表现为基质增强效应。因此，本实验采用基质匹配标准曲线，可降低对目标药物基质效应的影响。

2.4 方法学评价

2.4.1 方法线性范围、检出限、定量限 按照1.2.2前处理方法制备得到空白基质溶液，用空白基质液配成系列混合标准工作溶液，以59 种化合物基质匹配标准工作溶液的浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，得到59 种化合物线性范围、线性方程和决定系数（R2），结果显示，59 种化合物在其线性范围内，线性关系良好，决定系数均大于0.999，实验结果见表2。

表2 59 种化合物基质效应、线性关系、检出限、定量限Table 2 Matrix effects,LOD and LOQ of 59 analytes

将混合标准工作液，逐级稀释后加入凉茶阴性样品中，按1.2.2 前处理方法处理，上机测定，以目标峰信噪比（S/N）≥3 时样品浓度确定为检出限（LOD），S/N≥10 时样品浓度为定量限（LOQ），结果显示可知59 种化合物的检出限在5.0～10.0 μg/L 之间，定量限为10.0～25.0 μg/L 在之间，结果详见表2，表明该方法具有较高的灵敏度。

2.4.2 回收率与精密度 取阴性凉茶样品为基质，添加25、50、100 μg/L 低中高3 个浓度水平标准溶液，每个添加水平平行测试6 次，计算各化合物的平均回收率和相对标准偏差（RSD），由表3 可知，结果表明，加标浓度为25 μg/L 时，59 种化合物回收率范围为60.3%～121.7%，RSD 为2.0%～13.7%，加标浓度为50 μg/L 时，59 种化合物收率范围为70.2%～128.8%，RSD 为1.2%～13.1%，加标浓度为100 μg/L时,59 种化合物的平均回收率范围为66.3%～127.4%，RSD 为1.0%～13.2%，由此可见，回收率及精密度均能够满足定量分析的需求。

表3 59 种化合物平均回收率和精密度（n=3）Table 3 Recoveries and RSDs of 59 analytes spiked into blank matrix sample (n=3)

2.5 方法学比较

与其他已有关于凉茶中非法添加化学药物检测方法及标准进行比较（表4），从表4 中可看出，本方法在样品及提取溶剂使用量、检测药物数量、检测模式、仪器检测时间、检出限等方面具有优势，特别是在降低样品及试剂用量、提高检测效率、降低检测成本上优势明显。灵敏度方面与大部分研究相当，优于现有国家补充检验方法[36]。因此，所建方法灵敏、高效和可靠，可适用于凉茶中非法添加药物的快速、定量检测。

表4 micro-QuEChERs/LC-MS/MS 与其他已报道方法的比较Table 4 Comparison of micro-QuEChERs-LC-MS/MS with other reported methods

2.6 实际样品分析

采用本研究建立的方法，随机对从梅州本地市场购买的感冒茶、咽喉茶、口腔茶、咽炎茶、清热解毒茶、祛湿茶等共20 批次样品进行检测，结果显示20 批凉茶样品均未检出以上59 种化学药物。

3 结论

本研究以凉茶为对象，采用micro-QuEChERS前处理方法，超高效液相色谱串联质谱法检测，建立了同时测定凉茶中59 种非法添加药物的方法。该方法操作简便、检测效率高，药物覆盖面广，特别是大大减少了样品用量、试剂耗材用量，检测成本显著降低，与传统QuEChERS 前处理方式相比，有着明显的优势。对方法的检出限、定量限、精密度及基质效应进行方法学评价，本方法检出限为5.0～10.0 μg/L、定量限为10.0～25.0 μg/L，平均回收率为60.3%～128.8%，相对标准偏差（RSD）为1.0%～13.7%，检出限优于国家补充检验方法BJS 201713，回收率、精密度等均满足要求，该方法可以广泛应用于凉茶中非法添加药物快速筛查和定量检测，为凉茶风险监测提供技术支持。