淀粉-枸杞复合物的制备及其稳定性研究

李淑敏，郭晋彪，于金芝，周雅频，张 蕾，何希宏，郝利民,，张黎明,

（1.天津科技大学，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津 300457；2.军事科学院系统工程研究院，北京 100010）

枸杞（Lycium barbarum，LB），作为一种传统的药食同源类食品，在我国已有2000 多年的食用历史[1]。现有的研究表明，枸杞的生物活性物质主要有枸杞色素（Lycium barbarumpigment，LP）、枸杞多糖、氨基酸和微量元素等[2]，在调节机体新陈代谢、保护视觉、血糖调节、免疫调节、抗肿瘤活性和细胞保护等方面有着积极的效果[3]。

LP 是一种由类胡萝卜素和黄酮组成的活性物质，对枸杞生物活性的发挥起着关键作用[4]。然而，相较于枸杞中其它活性成分，LP 存在着稳定性差，不易保藏等问题。氧气、光照和高温是主要的诱导因素，容易使其发生褐变，导致其生物活性减弱，从而降低了LP 的生物活性和生物利用度[5]。目前，提高LP 稳定性的研究已逐渐受到关注，张春兰等[6]制备了LP 微乳液，通过添加抗氧化剂和EDTA-2Na 提高了LP 的稳定性；刘永等[7]通过海藻酸钠和壳聚糖作为LP 的载体，显著降低了高温、光照和氧气等诱导因素对LP 的破坏，延长其储藏期。但是这些方法存在着生产成本高、加工流程复杂等问题，因此不适于LP 包含体复合物的实际生产加工。

近年来，通过以淀粉作为载体制备复合物增加客体分子稳定性的研究已较为广泛。淀粉是一种由直链淀粉和支链淀粉以特定交错排列方式形成的晶体颗粒[8]。当存在疏水性客体分子时，直链淀粉可自发形成“内部疏水，外部亲水”的单螺旋空腔体结构[9]。疏水性客体分子可通过氢键、疏水相互作用和范德华力等非共价作用进入淀粉单螺旋空腔或镶嵌在两个螺旋空腔之间，从而形成复合物[10]。ANDREA等[11]制备了高直链淀粉-脂肪酸复合物，该复合物可显著降低氧气和温度对脂肪酸的影响，提高了脂肪酸的稳定性。WANG 等[12]所制备的直链淀粉-儿茶素复合物和HOYOS 等[13]制备的淀粉-杏仁油复合物也有相似的效果，所装载的客体分子的稳定性均显著提升。因此，本研究拟选择淀粉为载体，以LP 含量为指标，探索一种新型的有效保护枸杞活性物质的CS-LB 制备方法，通过考察其理化性质来揭示该复合物的形成方式，并进一步对该类复合物的稳定性进行考察，为LB 的高效利用提供新的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米淀粉（直链淀粉含量为27.5%，水分含量为12.7%）天津中英保健食品有限公司；枸杞（水分含量为10.2%）宁夏宁馨儿生物科技有限公司；β-胡萝卜素标准品（CAS：7235-40-7，HPLC≥98%）北京索莱宝科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

PB12 Power311 型高速破壁机 广东美的电器有限公司；Alpha 2-4 LD plus 型真空冷冻干燥机德国奇尔斯特公司；TU-1810PC 型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；Philips XL-30 型扫描电子显微镜 荷兰飞利浦公司；Rigaku D/max 2500X 射线衍射仪 日本理学株式会社；Pyris/Diamond 型热重分析仪 美国Perkin-Elmer公司；Vector-22 型傅里叶红外光谱仪 德国布鲁克仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 CS-LB 制备方法 CS-LB 的制备参照张黎明等[14]的方法并稍作修改。将8%的淀粉匀浆于90 ℃加热处理2 min 使淀粉预糊化，并按照一定质量比加入枸杞进行高速剪切处理，然后对样品进行真空冷冻干燥、研磨过筛处理。再利用无水乙醇洗涤3 次，于-80 ℃，0.35 atm 的条件下冷冻干燥24 h 并过100 目筛即得CS-LB。然后对其LP 的含量和包埋率进行测定。

1.2.2 制备条件的优化 利用复合物中LP 的含量和包埋率筛选复合物的较佳制备条件。首先在剪切速率8000 r/min、枸杞与淀粉质量比（干重）为3:1的条件下，将混合匀浆分别剪切不同时间（0.5～3 h，以30 min 为间隔）以确定制备复合物的较优剪切时间。在确定较优剪切时间后，固定枸杞与淀粉质量比（干重）为3:1，设置破壁机不同剪切速率（8000～28000 r/min，以4000 r/min 为间隔）高速剪切1.5 h以确定制备复合物的较优剪切速率。确定较优剪切速率和剪切时间后，在预糊化淀粉冷却过程中加入不同质量的枸杞，使枸杞:淀粉的质量比（干重）分别为1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，对枸杞与淀粉的质量比（干重）进行优化，以确定制备复合物的较优质量比。

1.2.3 对照样品的制备 枸杞粉的制备：称取一定质量的枸杞置于90 ℃的热水中加热处理2 min，然后在冷却至室温后，以32000 r/min 高速剪切混合2 min，之后12000 r/min 剪切1.5 h，然后真空冷冻干燥、研磨过100 目筛处理即得。预糊化淀粉的制备方法采用上述CS-LP 的制备方法，制备过程中不添加枸杞。物理混合物按照枸杞粉与预糊化淀粉的设定质量比称重，置于EP 管中并充分混合即得。

1.2.4 LP 含量和包埋率的测定 LP 中的主要成分为类胡萝卜素，本实验对LP 含量的测定以β-胡萝卜素为测定指标，测定方法参考Yazdani 等[15]并稍作修改。简言之，于波长λ=450 nm 处测定不同浓度β-胡萝卜素（0～100 μg/mL）的吸光值，以β-胡萝卜素浓度为X 轴，吸光值为Y 轴绘制的标准曲线为y=0.2366x-0.0032，R²=0.9993。LP 含量测定参考李小玉等[16]的方法，分别称取0.2 g LB 和CS-LB 溶于9 mL 蒸馏水中，静置15 min 后于6000 r/min 条件下离心5 min，弃上清液，后向沉淀中加入提取溶剂（石油醚:丙酮=1:1），充分振荡后超声提取15 min，反复3 次，收集上清液并用提取溶剂定容至50 mL，于450 nm 处测定吸光值，并按式（1）计算LP 的含量，按式（2）计算CS-LB 中LP 的包埋率。

式中：X，β-胡萝卜素含量，mg/g；C，β-胡萝卜素浓度，µg/mL；V，定容体积，mL；M，CS-LB 质量，g；R，LP 的包埋率，%；X1，CS-LB 中β-胡萝卜素含量，mg/g；X2，所添加LB 中的β-胡萝卜素总含量，mg/g。

1.2.5 CS-LB 的理化性质表征

1.2.5.1 扫描电子显微镜分析（SEM）将微量样品用导电胶固定在样品板上镀金膜，加速电压设为6 kV[17]，放大1000 倍观察样品的微观形貌。

1.2.5.2 X-射线衍射分析（XRD）取样品粉末放置铝片孔中，选用波长为541 nm 的单色Cu-Kα射线，设置电压为40 kV、电流为40 mA、起始角为3°、终止角为60°进行扫描[18]。

1.2.5.3 红外光谱分析（FT-IR）精确称取1.0 mg样品与100.0 mg 溴化钾混合，压片后进行光谱采集，空气背景做空白对照。

1.2.5.4 热重分析（TGA）精确称取10.0 mg 样品于坩埚中，起始、结束温度分别设置为25 ℃、600 ℃，升温速率为10 ℃/min 进行热重分析。

1.2.6 CS-LB 稳定性实验 CS-LB 稳定性实验参照李素云等[19]的方法，并稍作修改，LP 保留率按式（3）计算：

式中：X3为测定时CS-LP 中LP 的含量，mg/g；X4为CS-LP 中LP 的初始含量，mg/g。

1.2.6.1 温度对CS-LB 稳定性的影响 称取1.0 g样品，用透明袋真空包装，分别置于冷藏条件（4 ℃）、常温条件（25 ℃）、高温条件（50 ℃）下避光保存，于第0、2、4、8、12 d 取出部分测定LP 的含量。

1.2.6.2 氧气对CS-LB 稳定性的影响 称取1.0 g样品，常温条件下分别置于密封和敞口棕色瓶中保存，隔天取样测定LP 含量，分析两种条件下的LP 保留率。

1.2.6.3 光照对CS-LB 稳定性的影响 称取1.0 g样品，常温条件下分别置于黑暗和光照环境中保存，隔天取样测定LP 含量，分析两种条件下的LP 保留率。

1.3 数据处理

结果以平均值±标准差（X±SD）的形式表示，实验均重复测定3 次，采用SPSS 13.0 统计软件对测量结果进行统计学分析，Origin 2022 作图。显著性分析采用邓肯氏多重比较，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 制备条件对CS-LB 中LP 含量及其包埋率的影响

2.1.1 高速剪切时间对CS-LB 中LP 含量及其包埋率的影响 图1 为高速剪切时间对CS-LB 中LP 含量及包埋率的影响。由图1 可知，当剪切时间由0.5 h 延长至1.5 h 时，CS-LB 中LP 含量与包埋率均呈现平稳上升的趋势，在1.5 h 达到峰值，此时LP 含量和包埋率分别为1.060±0.004 mg/g、83.10%±0.33%；当剪切时间延长至3 h 时，LP 含量和包埋率均呈现下降的趋势。这可能是由于在剪切力的作用下，淀粉双螺旋结构被进一步破坏，单螺旋空腔的比例上升。同时，高速剪切处理使得枸杞细胞中的生物活性物质充分释放出来。枸杞中的疏水性物质可通过非共价作用进入直链淀粉的螺旋空腔中形成复合物[20]。然而，随着高速剪切的持续进行，可能是由于CS-LB 的结构发生破坏，导致复合物的包埋率降低，因此选择制备CS-LB 的较优剪切时间为1.5 h。

图1 高速剪切时间对淀粉-枸杞复合物中枸杞色素含量及包埋率的影响Fig.1 Effect of shear time on pigment content and embedding rate in starch-Lycium barbarum complex

2.1.2 高速剪切速率对CS-LB 中LP 含量及其包埋率的影响 图2 为高速剪切速率对CS-LB 中LP 含量及其包埋率的影响。由图2 可知，LP 的含量与包埋率的变化呈现类似的趋势，均先增后减。当剪切速率开始由8000 r/min 升高时，CS-LB 中LP 的含量及包埋率迅速上升，并在12000 r/min 时达到峰值，此时LP 含量和包埋率分别为1.02±0.01 mg/g，80.44%±0.92%。当剪切速率继续升高时，LP 含量和包埋率呈显著下降的趋势（P＜0.05）。因此，当剪切速率为12000 r/min 时，可较好地制备CS-LB。

图2 高速剪切速率对淀粉-枸杞复合物中LP 含量及包埋率的影响Fig.2 Effect of rotation rate on pigment content and embedding rate in starch-Lycium barbarum complex

2.1.3 枸杞/淀粉质量比对LP 含量及包埋率的影响

图3 为LB/CS 质量比（g/g）对LP 含量及包埋率的影响。由图3 可知，当LB 和CS 质量比在1:3到3:1 范围内，LP 的含量随CS 和LB 质量比的增加呈递增趋势，在LB 与CS 质量比为3:1 时，复合物中LP 含量最高0.99±0.03 mg/g，因此选择LB 和CS 质量比3:1 作为较优的制备比例。

图3 枸杞和淀粉质量比（g/g）对淀粉-枸杞复合物中LP 含量及包埋率的影响Fig.3 Effect of mass proportion (g/g) of Lycium barbarum to starch on pigment content and embedding rate in starch-Lycium barbarum complex

2.2 CS-LB 的理化性质表征

2.2.1 扫描电镜分析（SEM）图4 为玉米淀粉、预糊化淀粉、枸杞粉、物理混合物和淀粉-枸杞复合物的扫描电镜照片。从图4 可以观察到，CS 的构型呈多面体结构，大小不一，表面光滑，平均粒径约7 μm（图4A）。预糊化淀粉整体呈不规则片状，与王娜等[21]制备的预糊化淀粉形态类似，这可能是由于加热糊化破坏了CS 的结晶区域，直链淀粉扩展并形成了密集的网状结构（图4B）。枸杞粉呈团聚状，表面凹凸不平，大小不均，形态各异（图4C）。物理混合物可见枸杞粉和预糊化淀粉两种物质形态的存在，说明二者仅通过物理作用聚集（图4D）。CS-LB（图4E）表面分布小孔，颗粒大小近似，相较于预糊化淀粉体积变大，并伴有团聚现象的发生。另外，与物理混合物相比，包合物的表面平整度降低，其形态也发生了明显变化，由此可知LB 中的疏水性活性物质在高速剪切过程中与淀粉发生了包合络结作用[22]。

图4 玉米淀粉、预糊化淀粉、枸杞粉、淀粉和枸杞粉的物理混合物和淀粉-枸杞复合物的SEM 图（1000×）Fig.4 SEM micrographs of native starch,pre-gelatinized starch,Lycium barbarum powder,mixture of starch and Lycium barbarum powder,starch-Lycium barbarum complex (1000×)

2.2.2 X 射线衍射（XRD）分析结果 图5 为玉米淀粉、预糊化淀粉、枸杞粉、物理混合物和CS-LB 复合物的X 射线衍射图。由图5 可知，CS 在2θ为15.0°，17.0°，18.0°，23.5°处出现尖峰衍射，这是典型的A 型淀粉结晶的特征（图5a）。预糊化淀粉（图5b）相较于CS 衍射峰减弱或消失。当2θ为20.1°有较弱的衍射峰存在，这是由于CS 在加热作用下不断吸水溶胀导致其有序分子崩解并溶解，从而破坏了CS 的晶体结构[23]。枸杞粉呈无定型结构（图5c），物理混合物（图5d）未出现衍射峰，属于非结晶结构。而CS-LB（图5e）在2θ为18°、20°处出现V 型淀粉的特征衍射峰[24]，这说明CS 与枸杞粉高速剪切后促使淀粉晶型发生了由A 型向V 型的转变，且相对结晶度有所下降。这可能与直链淀粉的单螺旋空腔与LB 中的活性物质有关，Lee 等[25]报道称β-胡萝卜素可通过范德华力，疏水相互作用与CS 作用形成复合物；Zhao 等[26]通过使用多糖可与淀粉通过氢键，范德华力等非共价作用结合并形成V 型复合物；同时，多酚也具有类似的效果[27]。因此，直链淀粉和LB 中的活性物质结合形成CS-LB。

图5 玉米淀粉、预糊化淀粉、枸杞粉、淀粉和枸杞粉的物理混合物和淀粉-枸杞复合物的X 射线衍射图Fig.5 X-ray diffraction images of native starch,pre-gelatinized starch,Lycium barbarum powder,mixture of starch and Lycium barbarum powder,starch-Lycium barbarum complex

2.2.3 FT-IR 分析结果 图6 为CS、预糊化淀粉、枸杞粉、物理混合物和CS-LB 复合物的FT-IR 图谱。由图6 可知，LB 在包合前后代表各基团的吸收峰并未增加或减少，表明高速剪切处理不会对LP 的分子基团造成破坏（图6c 和图6e）。CS 在3421 cm-1处为羟基O-H 伸缩振动吸收峰，2925 cm-1处为饱和的C-H 伸缩振动吸收峰，1647 cm-1处为结合水的伸缩振动吸收峰[28]（图6a）。CS 与LB 粉的物理混合物在3421 cm-1处的O-H 吸收峰，以及1647 cm-1处的结合水吸收峰均变宽，且峰强变大，这是由于CS与LB 活性物质中O-H 吸收峰的缔合叠加造成的[29]（图6d）。与物理混合物相比，CS-LB 的3421 cm-1处吸收峰变强，且向高频处发生偏移。同时，1647 cm-1处的吸收峰变强。这可能是由于CS 与客体分子包结络合后，主客体通过氢键结合（图6e）。这表明形成的CS-LB 是以非共价键偶联结合的形式存在[30]。

图6 玉米淀粉、预糊化淀粉、枸杞粉、淀粉和枸杞粉的物理混合物和淀粉-枸杞复合物的FTIR 图Fig.6 FTIR diagram of native starch,pre-gelatinized starch,Lycium barbarum powder,mixture of starch and Lycium barbarum powder,starch-Lycium barbarum complex

2.2.4 热重分析结果（TGA）图7 为CS、预糊化淀粉、枸杞粉、物理混合物和CS-LP 复合物的热重分析图。由图7 可知，CS（图7a）的热损失分为两个阶段，第一阶段（50～100 ℃）主要与CS 中水分挥发有关，第二阶段（254～340 ℃）主要是CS 的分解，在此阶段CS 分子键发生断裂和碳化[31]。LB 粉（图7c）热损失也表现为两个阶段，第一阶段（50～100 ℃）是由于自由水的挥发，第二阶段的热损失主要是在高温条件下LB 活性物质发生分解（304～314 ℃）。CSLB（图7e）热损失分为三个阶段：第一阶段为水分的散失（50～100 ℃），第二阶段为外部CS 的部分碳化与所包含的LB 活性物质的部分分解（138～209 ℃），第三阶段为CS 的碳化与LP 的完全分解（221～372 ℃），CS-LB 的质量保留率为36%，高于物理混合物（图7d），这可能是由于CS-LB 中螺旋空腔与LB 活性物质通过非共价键缔合形成的结构更为稳定，在一定程度上提高了LB 活性物质的热稳定性[32]。

图7 玉米淀粉、预糊化淀粉、枸杞粉、淀粉和枸杞粉的物理混合物和淀粉-枸杞复合物的热重分析图Fig.7 TGA analysis of native starch,pre-gelatinized starch,Lycium barbarum powder,mixture of starch and Lycium barbarum powder,and starch-Lycium barbarum complex

2.3 CS-LB 的稳定性分析

2.3.1 温度对CS-LB 中LP 稳定性的影响 图8A为不同温度下包合前后的LP 保留率随保存时间的变化趋势图。由图8A 可知，环境温度越高，保存时间越长，LP 的保留率越低，而在同一温度下，CSLB 中的LP 保留率均高于LB 粉。其中，第12 d 时50 ℃条件下LB 粉的保留率仅为26.64%，而CSLB 中LP 的保留率为85.62%。原因在于高温会对LP 造成不可逆损伤，且当温度升高，时间延长，损伤越严重。CS-LB 中的LP 由于CS 的保护作用，降解速率减缓，且受高温影响作用降低，热稳定性明显提高。刘树兴等[33]研究的淀粉-姜黄色素复合物也可改善姜黄色素的热稳定性，本实验结果与之相似。

图8 不同条件对淀粉-枸杞复合物稳定性的影响Fig.8 Stable property of starch-Lycium barbarum complex under different conditions

2.3.2 氧气对CS-LB 中LP 稳定性的影响 图8B为氧气对LP 稳定性的影响。由图8B 可知，在有氧或无氧条件下，CS-LB 中LP 的保留率均高于LB粉，而在有氧条件下LP 保留率均低于无氧条件。第12 d 时，有氧条件下枸杞粉的LP 保留率为62.38%，而CS-LB 中LP 的保留率为91.22%，原因在于有氧条件下产生的氧自由基会掠夺化学键中的电子，使化学键失去稳定，导致LP 逐渐氧化分解[34]。而CSLB 可降低氧自由基对客体分子的破坏，保护LP，并提高其稳定性。鲍杰[35]曾探究氧气对玫瑰花渣复合物稳定性的影响，其结果也证明复合物化可显著提高色素的稳定性。

2.3.3 光照对CS-LB 中LP 稳定性的影响 图8C为光照对LP 稳定性的影响。由图8C 可知，光照下LP 的保留率相比于避光条件均较低，但无论光照与否，CS-LB 中LP 保留率均远高于LB 粉。第12 d 时，光照条件下LB 粉的LP 保留率为54.81%，而CSLB 中LP 的保留率为91.38%，原因在于紫外光线会破坏化学键，降低LP 稳定性，使其活性逐渐分解[36]。而CS-LB 使紫外光线无法穿过螺旋空腔，包埋其中的LP 无法被分解，稳定性明显提高。

3 结论

本研究采用高速剪切法制备了CS-LB，并以LP 含量和包埋率为指标，确定了较好的制备条件，当LB 和CS 质量比为3:1（g/g），剪切速率为12000 r/min，剪切时间为1.5 h，在此条件下得到CS-LB 中LP 的含量为0.99±0.03 mg/g。SEM 分析结果表明，所形成的CS-LP 与物理混合物相比，体积增大，表面粗糙程度增加；X 射线衍射分析表明，形成了V 型复合物，证明LB 中的疏水性活性物质被成功地结合在直链淀粉包合物的螺旋内腔中；FT-IR 分析结果表明，CS 与LB 活性成分通过非共价的形式结合形成复合物；与混合物相比，CS-LP 的热稳定性明显增强，可知预糊化淀粉与LB 活性成分发生了缔合作用。通过稳定性实验发现，CS-LP 在不同的温度、氧气以及光照条件下LP 的保留率均高于LB 粉。由此说明CS-LB 对LP 有较强的保护效果，能够有效提高LP 的稳定性，使其更好的发挥生物活性。