HPLC-MS/ MS 法同时测定微量血浆中甲氨蝶呤、左乙拉西坦、拉莫三嗪浓度及其临床应用

秦亚彬 张古英 赵德运

河北省儿童医院药学部，河北石家庄 050031

甲氨蝶呤是抗叶酸类抗肿瘤药，广泛应用于急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤等疾病的化疗[1-2]。研究显示，常规监测甲氨蝶呤血药浓度可以有效降低不良反应发生率[3-5]。左乙拉西坦和拉莫三嗪为第二代抗癫痫药，在患儿中有较好的疗效[6-8]。左乙拉西坦和拉莫三嗪联合应用或用于儿童、孕妇和肝肾功能异常的患者时，建议监测血药浓度[9-10]。

甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪均属于儿童治疗药物监测的常规品种[11-12]。实际临床治疗过程中存在癫痫患者联合使用两种抗癫痫药的现象，癫痫合并白血病患者有两种药物联用的可能。甲氨蝶呤和左乙拉西坦均为P-糖蛋白底物，两者联用可导致甲氨蝶呤的药动学参数发生变化，继而影响其浓度，增加肾毒性[13]。

HPLC-MS/MS 法具有良好的分离能力和选择性，可以同时检测多种药物，近年来被广泛用于治疗药物的监测工作[14-15]。儿童血管细小，采血困难。故本研究尝试采用微量血浆样本，建立同时测定甲氨蝶呤、左乙拉西坦、拉莫三嗪浓度的HPLC-MS/MS 法，以用于患儿血药浓度监测，为合理用药提供保障。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Agilent Ultivo 三重四极杆质谱仪（美国安捷伦公司）；低温高速离心机（北京白洋医疗器械有限公司）；涡旋混合器（杭州佑宁仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

甲氨蝶呤对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100138-201704，纯度：99.4%）；内标甲氨蝶呤-D3（上海源叶生物有限公司，批号：H17M9Q56012，纯度＞98.0%）；左乙拉西坦（成都德思特生物技术有限公司，批号：DST-190223-028）；内标左乙拉西坦-D6，（深圳海思安生物技术有限公司，批号：30001101，纯度：98%）；拉莫三嗪（中国食品药品检定研究院，批号：100775-201902，纯度：99.7%）；内标拉莫三嗪-13C3-D3（深圳海思安生物技术有限公司，批号：30002385，纯度：98%）；甲醇为色谱纯（赛默飞世尔科技有限公司）；甲酸为色谱纯（美国MREDA 公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；血浆均来源于河北省儿童医院。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件 分析柱为Agilent C18（50mm×2.1mm，1.8μm）；流动相0.1%甲酸水（A）和甲醇（B）梯度洗脱（0.00～0.50 min，98%→95%A；0.50～1.50 min，95%→5%A；1.50～2.40 min，5% A；2.41～2.50 min，95% →98% A；2.50～3.50 min，98%A）；柱温：45℃；自动进样器温度：8 ℃；流速为0.4 ml/min；进样体积：3 μl。

2.1.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源，正离子模式；鞘气温度：280 ℃，鞘气体积流量：11 L/min；喷嘴电压：500 V；雾化器压力：15 psi；毛细管电压：正电压4 000 V；干燥气温度：300 ℃，干燥气体积流量7 L/min；多反应监测扫描分析。

离子通道选择：甲氨蝶呤m/z 455.1→308.2，内标甲氨蝶呤-D3 m/z 458.1→311.1；左乙拉西坦m/z 171.1.4→126.2，内标左乙拉西坦-D6 m/z 177.2→132.2；拉莫三嗪m/z 256.1→211，内标拉莫三嗪-13C3-D3 m/z 262.1→217.1。碰撞能均为20 eV。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品及内标溶液制备 准确称取甲氨蝶呤10.3 mg 置于50 ml 容量瓶中，左乙拉西坦、拉莫三嗪各20 mg 置于5 ml 容量瓶中，甲氨蝶呤-D3、左乙拉西坦-D6、拉莫三嗪-13C3-D3 各1 mg 用甲醇/ 水（V/V=1/1）分别溶解，超声助溶并稀释至刻度，获得储备液。用甲醇/水（V/V=1/1）对储备液逐级稀释获得一系列浓度对照品的标准溶液及500 ng/ml 甲氨蝶呤-D3、30 μg/ml 左乙拉西坦-D6 和15 μg/ml 拉莫三嗪-13C3-D3 的混合内标溶液，-80℃冷冻保存。

2.2.2 标准曲线和质控样品制备 精密吸取50 μl 甲氨蝶呤、50 μl 左乙拉西坦和50 μl 拉莫三嗪各浓度标准溶液加入离心管中，再加入1 850 μl 空白血浆涡旋混匀，制成6 个浓度系列的混合标准曲线。甲氨蝶呤的浓度为25、50、100、500、1 000、1 500 ng/ml，左乙拉西坦的浓度为1、2、5、10、25、50 μg/ml，拉莫三嗪的浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、12.5、25.0 μg/ml。

另取适量储备液用空白血浆稀释制得3 个浓度水平的混合质控样品。其中甲氨蝶呤的质量浓度为75、300、1 200 ng/ml，左乙拉西坦的质量浓度为3、20、40 μg/ml、拉莫三嗪的质量浓度为1.5、10.0、20.0 μg/ml。

2.3 样品前处理

精密吸取10 μl 血浆样本，加入10 μl 混合内标溶液和100 μl 甲醇，涡旋1 min，11360 r/min 离心10 min，离心半径为50 mm，取50 μl 上清液，用水稀释5 倍后转移至进样瓶供进样分析。

2.4 方法学验证

根据《中华人民共和国药典》[14]生物样品定量分析方法验证指导原则，从选择性、残留、定量下限、校准曲线、准确度和精密度、稀释可靠性及稳定性方面对方法进行验证。

2.4.1 特异性考察 取6 个不同批次的空白血浆以等体积的甲醇/水（50/50）替代内标溶液，按“2.3”项下方法处理分析，记录空白血浆样品色谱图。另取上述6 份空白血浆配制成分析物标准血浆溶液，按“2.3”项下方法处理后进样，记录待测物和内标物的色谱图。结果显示，血浆中内源性物质不干扰甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪及其内标物的测定。见图1。

图1 左乙拉西坦、拉莫三嗪和甲氨蝶呤及内标物的典型色谱图

2.4.2 标准曲线与定量下限 将“2.2.2”项下6 个浓度的样品，按“2.3”项下方法处理后进样检测。采用最小二乘法进行回归拟合，求得直线回归方程并计算校正标样浓度。甲氨蝶呤在25～1 500 ng/ml 线性关系良好，标准曲线方程：Y=0.251 6X+0.003 4（r=0.998 9），定量下限为25 ng/ml；左乙拉西坦在1～50 μg/ml 线性关系良好，标准曲线方程：Y=16.687 6X+0.000 2（r=0.991 1），定量下限为1 μg/ml；拉莫三嗪在0.5～25.0 μg/ml 线性关系良好，标准曲线方程：Y=46.369 5X-0.059 9（r=0.999 1），定量下限为0.5 μg/ml。定量下限信噪比均＞5，符合定量要求。

2.4.3 精密度与准确度 混合质控样品和定量下限浓度样品按“2.3”项下方法处理后进样测定，每个浓度平行测定5 份，批内及批间准确度和精密度结果均符合要求。见表1。

表1 批内及批间精密度及准确度结果

2.4.4 基质效应取6 个不同个体来源的空白血浆，按“2.3”项下方法配置低、高浓度的混合质控样品，分别计算经内标归一化后的基质效应因子及变异系数（coefficient of variation，CV）。结果显示，经内标归一化后，各化合物基质效应因子的CV 均＜15%，样品测定不受基质的影响。见表2。

表2 各待测药物在人血浆中的基质效应

2.4.5 残留效应 系统残留分析是对定量上限样品分析后立即分析空白血浆样品。要求残留不超过待测物定量下限的20%，不超过内标峰面积的5%。结果显示，残留符合接受标准。

2.4.6 稀释可靠性 分别配制高于定量上限的标准样品，其中甲氨蝶呤质量浓度为30 μg/ml、左乙拉西坦和拉莫三嗪浓度均为100 μg/ml，用空白血浆稀释上述样品，使稀释后样品质量浓度在标准曲线的线性范围内，平行5 份，计算稀释后样品测定结果的准确度和精密度。结果均＜15%，符合标准。

2.4.7 稳定性 制备低、高浓度水平的混合质控样品，分别考察室温放置24 h、-20 ℃冻存2 周、反复冻融3次及自动进样器保存12 h 的稳定性。结果显示，甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪在以上条件下均不影响其测定准确度。见表3。

表3 稳定性结果

2.5 临床应用

建立的检测方法经验证后应用于治疗药物监测。2022 年10 月至2023 年3 月共检测了1 348 例患儿样本。患儿采血后置于EDTA 抗凝采血管，4 000 r/min离心10 min，离心半径为100 mm，取血浆；按“2.3”项下方法处理后检测。共检测甲氨蝶呤360 例，均为肿瘤维持性化疗患儿，大剂量输注甲氨蝶呤后24、48、72 h采血，其测定范围在0.055～132.350 μmol/L。左乙拉西坦830 例、拉莫三嗪158 例，均为癫痫患儿，口服左乙拉西坦或拉莫三嗪1 周以上（达稳态后），于清晨服药前采血（谷浓度），左乙拉西坦测定范围在1.00～44.19 μg/ml；拉莫三嗪测定范围在0.50～17.68 μg/ml。本研究经河北省儿童医院医学研究伦理委员会批准（医研伦审第202210 号）。

3 讨论

文献报道，HPLC-MS/MS 法主要用于同时测定多种理化性质相似的同类药物[15-17]。而本研究尝试同时检测理化性质相差较大不同类药物。在优化色谱和质谱条件时，尝试了不同比例的流动相和添加剂，最终采用梯度洗脱并且流动相添加甲酸的方法，使甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪均有合适的保留时间，峰形较好，无拖尾现象，可以满足检测要求。另外，与已知方法比较，本研究只需要10 μl 血浆，非常适用于儿童等采血困难群体[18-21]。

在生物样本分析的前处理方法中，蛋白沉淀法因其处理简便，易于操作，广受青睐[22]。本研究选择甲醇作为沉淀剂，待测物有足够的提取回收率，可以满足检测需求。样品前处理采用蛋白沉淀法，往往不能完全去除蛋白、盐类和磷脂，这些内源性干扰能引起基质效应[23]。本研究中采用与待测物结构相似的同位素标记作为内标，以降低基质效应的干扰。同位素内标具有与待测物相同的色谱行为，是HPLC-MS/MS 法最合适的内标[24]。另外，样品经蛋白沉淀法后的上清液，加水稀释5 倍后再进样，以降低基质干扰[25]。

本研究建立了可以同时测定血浆中甲氨蝶呤、左乙拉西坦和拉莫三嗪的HPLC-MS/MS 法，该方法可以用于治疗药物监测，也适用于药物相互作用及药动学研究，为药物的合理使用提供参考依据。

利益冲突声明：本文所有作者均声明不存在利益冲突。