基于渗透汽化膜分离技术制备无核白葡萄烈酒原酒的工艺优化及其安全性分析

黎进雪，王丁怡，武运 ，蒲富娟，张文昊，尹丽萍，达菊庆，李宁，党国芳，方川川

（1.新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.石河子工程职业技术学院，新疆 石河子 832000；3.新疆中信国安葡萄酒业有限公司，新疆 昌吉州 832299）

新疆因其地域、日照等相关原因，葡萄丰饶，其中吐鲁番地区90% 以上的葡萄种植品种都为无核白葡萄，在葡萄集中产区中位列全国第一[1]。吐鲁番无核白葡萄鲜果糖度很高、口感优质，是鲜食葡萄中的佳品。但其主要销售渠道为干果及鲜果加工，但干果生虫率较高，而鲜果掉粒较多，且鲜食葡萄自身有着不耐长途贮运的特性[2]，并且相关产品的可选择性较多，造成鲜食葡萄在上市期间市场上出现供过于求的现象，从而使得鲜食无核白葡萄产量过剩，出现大幅度浪费，这严重制约了吐鲁番地区葡萄产业蓬勃向上发展[3]。因此，采用质量较优的无核白葡萄进行酿造研究，不仅是酒类市场新产品的需要，也对提高无核白葡萄附加值及促进吐鲁番地区葡萄产业快速发展具有重大意义。

渗透汽化膜分离技术作为近40 年发展起来的一项高新技术[4]，它具有符合现代生产业发展需要的条件，即节能、优质、无污染等。膜是具有选择性分离功能的材料[5]，利用膜的选择透过性可代替传统蒸馏工艺，富集酒精、提高酒度以达到高度酒的生产标准。李天宇等[6]表示，在白酒的基酒处理中，渗透汽化膜将会表现出更多的应用潜力，为酒企业解决实际生产问题。谭淑娟[7]也对渗透汽化膜在发酵酒脱醇过程中的应用进行了研究。曾里等[8]使用新型硅橡胶复合膜分离干红葡萄酒时，发现渗透汽化膜对乙醇的通透量影响极大，乙酸乙酯、异戊醇等醇类、酯类物质也能较好地通过，这表明膜渗透汽化技术是一项全新的分离葡萄酒方法。

随着人们生活水平的提高，大众选择酒类逐渐从性价比转换到安全性，故需对高度酒的安全性进行深入研究，葡萄酒中的氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、生物胺（biogenic amines，BA）[9]都制约着葡萄酒行业的健康蓬勃发展，全莉等[10]通过监测葡萄酒酿造及贮藏过程OTA 的变化规律，探究OTA 对新疆葡萄酒品质的影响，结果表明在白葡萄酒酿造过程中OTA 含量呈显著下降趋势。邓玉杰等[11]通过对新疆不同地区生产的葡萄酒中8 种BA 含量进行测定，结果表明和田地区葡萄酒中总生物胺含量最少，为新疆地区葡萄酒中BA 的安全品质控制提供依据。邹弯等[12]对贮存过程中EC 含量变化进行了研究，并建立了预测贮存过程中EC 含量的方程。

因此，本研究以无核白葡萄为原料，经发酵、富集得到无核白葡萄烈酒，并通过相关安全性检测试验，保障无核白葡萄烈酒的安全性，证明渗透汽化膜技术可适用于酿酒行业，以期为无核白葡萄加工发展新途径、革新酿酒工艺提出科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无核白葡萄（初始糖度219.5 g/L，总酸4.7 g/L）：市售；酿酒酵母、白佳酿酵母：意大利爱赛科有限公司；焦亚硫酸钾：天津名人生物科技有限公司；果胶酶RF（果胶酶ROHAVIN Flash，酶活力8 600 U/g）：法国拉氟德公司；甲醇、叔戊醇、赭曲霉毒素A（纯度均≥99%）、组胺盐酸盐、β-苯乙胺盐酸盐、酪胺盐酸盐、色胺盐酸盐（纯度均>99%）、腐胺盐酸盐、尸胺盐酸盐、1，7-二氨基庚烷（纯度均>98%）、亚精胺盐酸盐、章鱼胺盐酸盐、精胺盐酸盐（纯度均>97%）、冰乙酸、乙腈（均为色谱纯）：四川省维克奇生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

VELO/DPC-200 气囊压榨机：意大利velp 公司；PDMS 商用复合膜：南京九思高科技有限公司；LC40 高效液相色谱仪、GC-2030 气相色谱仪：日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 无核白葡萄净汁的制备

鲜食无核白葡萄经清洗、除梗、压榨取汁，分别添加0.02 mL/L 果胶酶RF、0.05 g/L 偏重亚硫酸钾，低温澄清24 h，得到鲜食无核白葡萄净汁，进行后续试验。

1.3.2 单因素试验设计

以无核白葡萄为原料，通过单因素试验分别研究初始糖度、发酵温度、酵母添加量对无核白葡萄烈酒原酒酒精度的影响。单因素试验因素及水平见表1。

表1 单因素试验因素及水平Table 1 Factors and levels of single factor test

1.3.3 响应面试验设计

在单因素试验结果基础上，进行三因素三水平的响应面试验，以酒精度为响应值，确定无核白葡萄烈酒原酒的最佳工艺参数。响应面试验因素与水平见表2。

表2 响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface test

1.3.4 基本理化指标测定

酒精度根据GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》进行测定[13]；总酸含量根据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定[14]；微生物检测参照戴奕杰[15]方法进行测定。

1.3.5 无核白葡萄烈酒的制备

渗透汽化膜生产无核白葡萄烈酒工艺见图1。

图1 渗透汽化膜生产无核白葡萄烈酒工艺Fig.1 Process of producing seedless white grape spirit by pervaporation membrane

第一阶段：利用分离膜，将无核白葡萄原酒在合适的温度和分离时间条件下进行分离，酒精、部分水及挥发性香气成分透过膜富集，在低真空状态下汽化，通过冷凝收集得到酒精浓度明显提升的渗透液，即酒精度较高的葡萄烈酒。进料温度：45 ℃；运行时间：12 h；原料循环泵流量为48 m³/h；膜上游侧原料循环系统压力≤0.3 MPa；膜下游真空系统压力为5 kPa；载冷剂温度：-10~-15 ℃。

第二阶段：继续利用分离膜，对第一阶段的渗透液进行分离，膜的透过侧最终富集得到高酒精度的无核白葡萄烈酒。进料温度：45 ℃；运行时间：12 h；原料循环泵流量为20 m³/h；膜上游侧原料循环系统压力≤0.3 MPa；膜下游真空系统压力为2 kPa；载冷剂温度：-10~-15 ℃。

1.3.6 无核白葡萄烈酒安全性测定

1.3.6.1 甲醇含量的测定

根据GB 5009.266—2016《食品安全国家标准食品中甲醇的测定》[16]中的方法进行测定。

1.3.6.2 重金属残留-铁离子含量的测定

根据GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[14]中的方法进行测定。

1.3.6.3 生物胺含量的测定

根据GB 5009.208—2016《食品安全国家标准食品中生物胺的测定》[17]中的方法进行测定。

1.3.6.4 赭曲霉毒素A 含量的测定

根据GB 5009.96—2016《食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A》[18]中的方法进行测定。

1.3.6.5 氨基甲酸乙酯含量的测定

根据GB 5009.223—2014《食品安全国家标准食品中氨基甲酸乙酯的测定》[19]中的方法进行测定。

1.4 数据处理

采用Excle 2019 进行相关数据统计；运用Origin 95绘制数据图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

不同酵母添加量、初始糖度、发酵温度对无核白葡萄原酒发酵过程中酒精度的影响见图2。

图2 酵母添加量、初始糖度、发酵温度对无核白葡萄烈酒原酒发酵过程中酒精度的影响Fig.2 Effect of yeast addition，initial sugar content，and fermentation temperature on alcohol content of raw seedless white grape wine during fermentation

由图2A 可知，酒精度与酵母添加量呈正比，酵母添加量增加，发酵周期则缩短，酒精转化量增大；若酵母添加量持续增加，酒精转化量增加不明显，且酵母整体风味较为明显，干白特有口感降低，故确定酵母添加量为0.2、0.3、0.4 g/L 进行后续响应面试验；由图2B 可知，随着发酵温度升高，酒精转化量增加，且发酵时长缩短，但酒精度上升逐步平缓，16 ℃与20 ℃发酵下的酒精转换量差异较小，且发酵温度在20 ℃时，酒体因为温度过高会损失部分干白的特别香气，导致风味、口感较差，故确定发酵温度为14、16、18 ℃进行后续响应面试验；由图2C 可知，初始糖度越高，酒精产量越高，糖度在27 °Brix 时酒精度最高，但过高糖度会影响酵母生长，使发酵滞留或暂停发酵，造成发酵周期过长，故确定初始糖度为21、23、25 °Brix 进行后续响应面试验。

2.2 无核白葡萄烈酒发酵条件的优化

2.2.1 响应面试验设计与结果

由单因素试验结果综合考量，选择使用酵母添加量（A）、发酵温度（B）、初始糖度（C）作为自变量，使用无核白葡萄烈酒原酒的酒精度（Y）作为响应值，响应面试验设计结果见表3。

表3 无核白葡萄发酵条件响应面试验设计结果Table 3 Response surface design results of seedless white grape fermentation conditions

经多元回归方程拟合，建立以鲜食无核白葡萄烈酒原酒的酒精度为评价指标的拟合方程：酒精度（Y）=11.82+0.5A+0.48B+0.54C-0.2AB-0.075AC+0.1BC-0.22A2-0.45B2-0.67C2。对该回归方程进行方差分析，结果见表4。

表4 回归模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

由表4 可以看出，多元回归模型F=21.99，P<0.01，该模型极显著；失拟项F=5.83，P>0.05，失拟项不显著，表明各因素（A、B、C）与响应值（Y）之间存在较为良好的线性关系；决定系数R2=0.965 8，校正系数R2Adj=0.921 9，不能被该回归方程解释的变异不到1%，说明回归方程拟合度较为优异，能够较为准确地对响应值（酒精度）进行分析预测。对表4 进行结果分析，可以看出模型中一次项A、B、C以及二次项B2、C2影响极显著（P<0.01），表明三因素与响应值之间存在较为复杂的线性关系，且根据三因素的F值可知，各因素对响应值（酒精度）的影响顺序为A>C>B，即酵母添加量对无核白葡萄烈酒原酒的酒精度影响最大，其次是初始糖度，发酵温度对无核白葡萄烈酒原酒的影响最小。由交互项的F值可以看出，AC及BC影响无核白葡萄烈酒原酒酒精度的交互作用小于AB。

2.2.2 响应面分析

为验证两因素交互作用对响应值的影响[20]，各因素间三维响应面及等高线见图3。

图3 各试验因素交互作用的响应面和等高线Fig.3 Response surface and contour plots of interaction of experimental factors

由图3 可知，各单因素均对响应值产生影响，且响应值随着因素水平的上升，呈先上升后逐步下降的趋势。且发酵温度和初始糖度的响应面坡度较小，等高线趋于圆形，说明两者之间的交互作用相对较小，对响应值的影响较小。

2.2.3 响应面验证试验

通过使用Design Expert V8.0.6 软件优化回归方程中发酵工艺参数，确定无核白葡萄烈酒原酒的最佳工艺：酵母添加量0.4 g/L、初始糖度23.74 °Brix、发酵温度16.7 ℃。此条件下，预测无核白葡萄烈酒原酒的酒精度为12.318% vol。为保证试验的可实施性，调整工艺条件为酵母添加量0.4 g/L、发酵温度17 ℃、初始糖度24 °Brix，并重复试验3 次，最终得出无核白葡萄烈酒原酒的酒精度为12.2% vol。通过渗透汽化膜分离技术，得到的无核白葡萄烈酒酒精度为53% vol，得出结果与预测结果基本吻合，表明该模型可用于无核白葡萄烈酒原酒发酵工艺参数的预测。

2.2.4 无核白葡萄烈酒的理化指标结果分析

无核白葡萄烈酒各项指标：细菌总数≤40 CFU/mL；大肠杆菌≤3 MPN/100 mL；酒精度53% vol，总酸含量0.28 g/L；未检出致病菌，符合国家标准。

2.2.5 无核白葡萄烈酒安全性测定结果分析

2.2.5.1 无核白葡萄烈酒中甲醇、Fe3+含量分析

通过对无核白葡萄烈酒原酒，以及渗透汽化膜一次及二次过膜酒样（无核白葡萄烈酒）中的甲醇及Fe3+进行定量分析和安全性评估，结果如表5 所示。

表5 无核白葡萄烈酒原酒及烈酒中甲醇、Fe3+含量Table 5 Content of methanol and Fe3+ in raw seedless white grape wine and its spirits mg/L

由表5 可知，原酒中的甲醇含量低于无核白葡萄烈酒，表明渗透汽化膜对甲醇分子具有较好的选择透过性。参考GB 2757—2012《食品安全国家标准蒸馏酒及其配制酒》[21]中相关规定，水果蒸馏酒中的甲醇含量≤2 g/L，即远大于无核白葡萄烈酒的甲醇含量，故无核白葡萄烈酒原酒及烈酒均符合国家相关限量标准。葡萄酒中含有适量的金属元素会对人体产生较好的保护机制，过量则会在酒中与其他物质产生络合反应，让酒体产生浑浊和沉淀，影响酒的色泽和口感。金属元素以铁和铜为主，且铁所导致的铁破败病更容易出现[22]，故葡萄酒中的Fe3+关系着酒体的品质问题。GB/T 15037—2006《葡萄酒》[23]中对Fe3+有明确要求，葡萄酒中Fe3+含量应低于8 mg/L。由表5 可知，无核白葡萄烈酒原酒及烈酒中Fe3+含量均符合国家标准，且通过渗透汽化膜一次富集及二次富集，Fe3+的含量逐步下降，这可能是Fe3+无法通过渗透汽化膜孔径所导致。

2.2.5.2 无核白葡萄烈酒中生物胺含量分析

对无核白葡萄烈酒原酒、渗透汽化膜一次过膜酒样及二次过膜酒样（即无核白葡萄烈酒）中的9 种BA进行定量分析和安全性评估，结果如表6 所示。

表6 无核白葡萄原酒及烈酒中BA 检测结果Table 6 Test results of BA in raw seedless white grape wine and its spirits mg/L

由表6 可知，尸胺、组胺、酪胺、精胺在3 种酒样中均为检出，腐胺只在烈酒原酒中检出，其余4 种生物胺均有检出。经过渗透汽化膜一次富集、二次富集后，色胺整体呈小幅增加趋势，苯乙胺、章鱼胺经过一次过膜、二次过膜呈较大幅度的下降趋势，亚精胺的变化趋势不明显，这可能是因为渗透汽化膜对大分子物质的透过性较低。组胺在BA 中毒性最强，多国已经对葡萄酒中的组胺设立了明确的限量标准（法国规定葡萄酒中的组胺含量≤8 mg/L，澳大利亚和瑞士≤10 mg/L）[24]，3 种样品中均为检出组胺，故应用渗透汽化膜分离技术酿制无核白葡萄烈酒的安全性较高。

2.2.5.3 无核白葡萄烈酒中赭曲霉毒素A、氨基甲酸乙酯含量分析

对无核白葡萄烈酒原酒、渗透汽化膜一次富集及二次富集（无核白葡萄烈酒）中的OTA、EC 进行定量分析和安全性评估，检测结果如表7 所示。

表7 无核白葡萄烈酒原酒及烈酒中OTA 及EC 检测结果Table 7 OTA and EC test results of raw seedless white grape wine and its spirits μg/L

由表6 可知，3 种样品中无核白葡萄烈酒未检测出OTA，烈酒原酒及一次过膜酒样中OTA 含量也较低。国际葡萄与葡萄酒组织（International Organization of Vine and Wine，OIV）规定，葡萄酒中OTA 的限量标准为2.0 μg/kg[25]，在GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》[26]中也有明确规定，OTA 含量不得超过2.0 μg/kg，无核白葡萄烈酒原酒及烈酒中OTA 含量均未超过相关限量标准。3 种样品中均检测出EC，且通过渗透汽化膜分离技术制备的无核白葡萄烈酒与烈酒原酒相比，含量下降明显。加拿大对酒类中的EC 含量做了较为清晰的规定[27]，即葡萄酒中EC 质量浓度<30 μg/L、水果白兰地EC 质量浓度<500 μg/L，因此，无核白葡萄烈酒原酒及烈酒EC 含量均未超过限量标准。

3 结论

为得到优质的无核白葡萄烈酒原酒以及无核白葡萄烈酒，本文通过单因素及响应面试验优化鲜食无核白葡萄的发酵工艺，得出发酵无核白葡萄的最优条件为酵母添加量0.4 g/L、发酵温度17 ℃、初始糖度24 °Brix，其原酒酒精度为12.2% vol。通过渗透汽化膜分离技术富集后，烈酒酒精度为53% vol。同时，对渗透汽化膜分离技术制备的无核白葡萄烈酒进行安全性分析，各指标均未超过相关限量标准，安全性较高。表明渗透汽化膜分离技术可用于高度酒的生产，是较为优秀的绿色工艺。未来应对渗透汽化膜分离技术制备的烈酒进行香气及感官评价，深入了解此工艺制备的高度酒的品质，为渗透汽化膜分离技术的应用提供参考。