超声波和碱性蛋白酶处理对克氏原螯虾脱壳及虾仁品质的影响

张喜才，张新林，黄业传，陈清婵

（1.荆楚理工学院 农业生物技术研究所，湖北 荆门 448000；2.荆楚理工学院 生物工程学院，湖北 荆门 448000；3.荆门（中国农谷）农业科学研究院，湖北 荆门 448000）

克氏原螯虾俗称小龙虾，其蛋白质含量高、营养丰富全面，深受广大消费者的欢迎，市场价值达千亿规模，而湖北是小龙虾的重要产地，2021 年全省小龙虾的养殖面积达597 733.3 公顷，产量约占到了全国的一半[1-2]。小龙虾的加工品以速冻虾仁为主，但是小龙虾虾壳较为坚硬，虾肉与虾壳紧密相连，导致脱壳十分困难，小龙虾的工厂加工仍然以工人手工操作为主，生产效率低，劳动强度大[3]，国内目前采用的工艺是将小龙虾进行蒸煮热烫，然后常温水和冷却水冷却处理、脱壳，但是这种方法存在虾仁营养流失、品质不够新鲜、产品得率较低的问题，超高压处理可以一定程度上提高脱壳效率和虾仁品质，但是设备成本和操作费用昂贵[4]，因此小龙虾如何高效、经济脱壳成为了工厂化加工的技术瓶颈。

虾类腹部结构分为三部分，由内到外分别为肌肉（虾仁）、表皮和外壳，表皮与肌肉通过广泛交叉的连接组织牢固地结合，有研究表明连接结构的结缔组织主要是由胶原蛋白组成，所以脱壳的关键点在于破坏此结构的胶原蛋白，从而使其连接部位松动[4]。研究表明虾类体内的内源酶和来自微生物的外源性蛋白酶可以促进壳肉分离，内切蛋白酶能够显著促进北极甜虾的脱壳[5]。碱性蛋白酶是食品行业应用广泛的内切蛋白酶，能够降解表皮和真皮的连接蛋白[6-7]，对于胶原蛋白具有良好的水解效应[5]。超声波是指频率高于人类听觉范围（>20 kHz）的声波，应用于食品加工可以产生空化效应、热效应和机械效应，空化是一种气泡形成、生长和破裂的现象，空化气泡的破裂会产生冲击波、微射流、湍流和剪切力等物理效应[8]，据报道超声波处理可以促进番茄的去皮，改善番茄的去皮效果[9]。相关研究表明，超声波可以增强酶对底物的亲和力，使酶的结构转变，暴露催化中心和结合位点，以及使物料结构松动便于酶进入内部，从而促进酶促降解效应[10]。截止目前，尚未有超声波和酶处理用于促进克氏原螯虾脱壳的报道。

相对于热烫冷却壳肉分离的加工工艺，本研究在减少热烫时间的基础上，采用碱性蛋白酶和超声波对克氏原螯虾进行处理，比较分析传统热烫加工及不同浓度的酶和不同功率超声波处理对克氏原螯虾壳肉分离功、产品得率以及虾仁品质的影响，以期为克氏原螯虾的加工工艺优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活克氏原螯虾（小龙虾）[质量（40±2）g]：湖北仁尚仁食品有限公司；碱性蛋白酶（200 U/mg）：湖北裕盈生物科技有限公司；2，4-二硝基苯肼（分析纯）、KCl-Tris 缓冲液（化学纯）、氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

质构仪（TA.XT Plus） ：英国stable micro system 公司；色差仪（CR-400）：日本柯尼卡美能达公司；离心机（H-2050R-1）：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；嫩度仪（C-LM3B）：北京天翔飞域科技有限公司；紫外可见分光光度计（WFZ UV-2100）：尤尼柯（上海）仪器有限公司；Bradford 蛋白浓度试剂盒：南京建成生物工程研究所；超声波清洗仪（GT1222）：深圳冠博科技有限公司；电子鼻（PEN3）：德国Airsense 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的处理

将小龙虾清洗干净后，随机分为9 组，每组30 只，分别处理如下。对照组：沸水热烫4 min 常温水及冷水依次冷却。组2：沸水热烫1 min，室温下0.5% 碱性蛋白酶酶液浸泡2 h，冷水漂洗，标记为0.5%。

组3：沸水热烫1 min，室温下1.0% 碱性蛋白酶酶液浸泡2 h，冷水漂洗，标记为1.0%。

组4：沸水热烫1 min，室温下300 W 超声波处理2 h，冷水漂洗，标记为300 W。

组5：沸水热烫1 min，室温下600 W 超声波处理2 h，冷水漂洗，标记为600 W。

组6：沸水热烫1 min，室温下0.5% 碱性蛋白酶酶液、300 W 超声处理2 h，冷水漂洗，标记为0.5%+300。

组7：沸水热烫1 min，室温下0.5% 碱性蛋白酶酶液、600 W 超声波处理2 h，冷水漂洗，标记为0.5%+600。

组8：沸水热烫1 min，室温下1.0% 碱性蛋白酶酶液、300 W 超声波处理2 h，冷水漂洗，标记为1.0%+300。

组9：沸水热烫1 min，室温下1.0% 碱性蛋白酶酶液、600 W 超声波处理2 h，冷水漂洗，标记为1.0%+600。

1.3.2 壳分离功

参考杨肖杰[11]的方法并略作改动，将经过预处理的小龙虾去除头部并称重，背部划线，然后将虾仁其中一端用探针穿过并固定在质构仪的底板上，夹具固定尾部与质构仪探头连接，在张力模式下测试，触发力5.0 g，以1 mm/s 的速度将壳拉离60 mm 的距离。根据Load-距离曲线计算壳肉分离所需要的总功，然后除以脱壳后所称质量得到壳分离功。

1.3.3 虾仁得率

称量鲜活小龙虾的质量及所得虾仁的质量，虾仁得率为虾仁质量与鲜活小龙虾质量的比值，以百分数表示。

1.3.4 虾仁完整率

脱壳后对虾仁进行观察，以虾仁的肌肉是否完整和尾部是否断裂作为判断依据，虾仁完整率为完整虾仁数与虾仁总数的比值，以百分数表示。

1.3.5 离心损失

参考汪兰等[12]的方法，将取得的虾仁称重，然后在4 500 r/min 下离心10 min 后称重。离心损失为离心后虾仁质量损失与新鲜虾仁质量的比值，以百分数表示。

1.3.6 嫩度

以剪切力作为嫩度指标，根据陈佳奇等[13]的方法测定，每组6 个重复。

1.3.7 虾仁质构

选择P/36R 探头，取虾仁中间部位进行质地多面剖析法（texture profile analysis，TPA）模式测定，速度设置为测前2 mm/s，测后2 mm/s，来回循环两次，每组6个重复，得到不同试验组小龙虾虾仁的硬度、弹性、咀嚼性、内聚性。

1.3.8 虾仁色泽

利用色差仪对虾仁的背部和腹部在Lab 模式下进行测定，考察不同处理组亮度L* 值、红绿a*值及黄蓝b*值的变化。

1.3.9 虾仁气味

参照沙小梅等[14]的方法，采用电子鼻检测无任何处理的新鲜虾仁、对照组、超声300 W 处理组、0.5%+300 处理组、1.0%+600 处理组，对5 个组的所有传感器响应值进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

1.3.10 肌原纤维蛋白含量、酶活

依据张喜才[15]的方法，分别测定不同处理组的肌原纤维蛋白含量、蛋白酶活性。

1.4 数据统计与处理

所有样品取样随机重复3 次，试验除注明外均重复3 次，采用SPSS 软件对所有数据统计分析，数据以平均值±标准差表示，p<0.05 被认为具有显著差异，采用Origin 2018 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同处理方式对小龙虾壳分离功的影响

小龙虾的外壳与虾仁之间通过结缔组织紧密连接，壳分离功的大小取决于剥离过程中外壳肌肉连接的松紧程度，壳分离功越小，意味着脱壳越容易。不同处理组的壳分离功如图1 所示。

图1 不同处理方式对小龙虾壳分离功的影响Fig.1 Effects of different treatment methods on separation work of Procambarus clarkii shells

由图1 可知，对照组的壳分离功低于单独的碱性蛋白酶处理组，而单独采用超声波处理的壳分离功最大，显著高于对照组。对照组由于采用了4 min 的热烫工艺，显著降低了壳分离功，李高尚等[16]的研究结果也表明热烫可以提高脱壳效率，这也是目前工厂采用热烫法脱壳的主要原因。碱性蛋白酶虽然可以高效水解连接部位的胶原蛋白，但是试验结果表明无论是0.5% 或者0.1% 的浓度，效果都不理想，主要原因可能是因为小龙虾外壳坚硬致密，蛋白酶溶液不能充分与连接部位接触。0.5%+300 处理组相对于对照组，壳分离功降低了约21.8%，说明碱性蛋白酶和超声波联合使用，具有良好的壳肉松动的效果。超声具有空化效应，产生大量的气泡冲击[17]，削弱了肌肉-壳的连接紧密程度，有利于碱性蛋白酶溶液发挥水解作用。但是0.5%+600、1.0%+300、1.0%+600 处理组的壳分离功相对于0.5%+300 处理组，并没有显著差异，说明0.5%+300处理组对于小龙虾壳肉连接部位的水解已接近上限。

2.2 不同处理方式对小龙虾虾仁完整率和虾仁得率的影响

不同处理方式对小龙虾虾仁完整率和虾仁得率的影响如图2 所示。

图2 不同处理方式对小龙虾虾仁完整率和虾仁得率的影响Fig.2 Effects of different treatment methods on shrimp completeness rate and yield of Procambarus clarkii

由图2 可知，单独碱性蛋白酶处理组和超声波处理组的虾仁完整率低于对照组，说明延长热烫时间有利于虾仁与虾壳的脱离，但是对照组的虾仁完整率只有89%，有部分虾仁的肌肉与外壳黏连、虾尾局部断裂，而碱性蛋白酶-超声波联合处理组虾仁完整率均达到了100%，说明碱性蛋白酶-超声波协同作用有利于提高虾仁的完整率。对照组的虾仁得率高于单独酶处理组和超声处理组，0.5%+300 处理组相对于对照组则有显著提升，提高了约31%。0.5%+300 处理组与其他3 组联合处理组差异不显著，但是1.0%+300、1.0%+600处理组虾仁得率呈现出下降趋势，有可能是碱性蛋白酶的水解作用过度，破坏力肌原纤维的结构，溶解了部分肌原纤维蛋白，导致虾仁得率降低[18]。

2.3 不同处理方式对小龙虾质构的影响

质构是评价虾仁品质的重要指标，不同处理方式的小龙虾虾仁质构如图3 所示。

由图3 可知，对照组相比其他处理组硬度、弹性、咀嚼性更大，因为对照组热烫时间较长，而热烫可以导致肌原纤维蛋白变性，进而导致虾仁硬度增大，同时弹性也有一定的增强，这与汪兰等[12]的研究结果一致，传统意义上认为硬度较高是虾仁的良好指标，但是在实际的感官评定中，加热过程中过高的硬度会导致口感粗糙[19]。0.5% 与1.0% 的碱性蛋白酶处理，导致硬度和弹性下降，原因是碱性蛋白酶降解部分结缔组织和肌原纤维蛋白，导致虾仁的结构变得松弛。高功率的超声波（600 W）也可以导致部分蛋白变性，结缔组织结构变得松散，一定程度上降低硬度和弹性。热处理同样可以提高咀嚼性和内聚性，主要原因是肌原纤维三、四级结构的破坏，空间结构的改变导致肌纤维密度改变[20]。0.5%+300 处理组相对于对照组在硬度、弹性、咀嚼性上略有降低，但是差异并不显著，而0.5%+600、1.0%+300、1.0%+600 3 个处理组在质构上相对于对照组有明显变化。

2.4 不同处理方式对小龙虾虾仁色泽的影响

色泽是影响虾仁感官评定的重要指标，不同处理方式的小龙虾虾仁色泽变化如表1 所示。

表1 超声波和酶处理对小龙虾虾仁色泽的影响Table 1 Effect of ultrasound wave and enzyme treatment on color of Procambarus clarkii shrimp

由表1 可知，热烫对于虾仁的亮度L*值有一定的提升，其原因是热烫使肌原纤维蛋白与肌浆蛋白变性聚集，虾仁表面发生光散射，导致亮度增加[21]，而其他处理组L*值、a*值、b*值低于对照组。有研究表明加热使虾仁表面色泽变红，推测原因主要有两方面，一是虾仁肌肉中的血红素不稳定，与其结合的蛋白质受热变性解离，导致血红素的游离；二是蛋白质变性使虾仁中的虾青素游离，虾仁表面变红[22]，除对照组外，其他处理组虾仁亮度略低，但是保持了较低的红度和黄度。表1 的结果表明单独超声波处理对虾仁色泽影响很小，研究表明超声对虾青素的提取有一定的促进效果[23]。超声-蛋白酶联合处理则对虾仁的亮度L*值影响较大，0.5%+300 处理组虽然亮度低于对照组，差异并不显著，a*值则显著低于对照组，因此0.5%+300 处理组虾仁表面色泽综合评价优于对照组。

2.5 不同处理方式对小龙虾虾仁离心损失和嫩度的影响

离心损失和嫩度直接影响到虾仁的口感，是鲜度评价的重要指标，不同处理组的小龙虾虾仁持水力和嫩度如图4 所示。

图4 不同处理方式对小龙虾虾仁离心损失和嫩度的影响Fig.4 Effects of different treatment methods on centrifugal loss and tenderness of Procambarus clarkii shrimp

水产品的离心损失象征肌肉的持水力，与蛋白质的结构和性质密切相关[15]；嫩度则与虾仁组织的含水量密切相关，可以用剪切力来表示[24]。由图4 可以看出，对照组的离心损失显著高于其他处理组，单独的酶处理和超声处理组之间的差异不大，超声处理组略高于酶处理组，说明虾仁受热之后蛋白变性，持水能力下降，品质劣化。碱性蛋白酶-超声波联合处理0.5%+300 处理组离心损失最低，而1.0%+600 处理组离心损失较0.5%+300 处理组有显著的增加。不同处理组的剪切力变化与离心损失的变化趋势相近，说明持水能力与嫩度密切相关，0.5%+300 处理组与其他几组相比具有最高的嫩度，适度的蛋白水解和超声处理可以提高虾仁的持水力和嫩度，但是过度的水解和过高功率的超声处理则可能带来相反的作用。高功率超声处理引起虾仁嫩度下降及口感粗糙，其原因可能与肌原纤维蛋白的机械结构遭到破坏有关，这与唐福元等[25]的研究结果相一致。

2.6 不同处理方式对小龙虾虾仁气味的影响

电子鼻的10 个传感器分别对应不同的挥发性化合物，而这些代表性的化合物组成了虾仁的独特气味，经过对不同处理组的传感器数据进行PCA 分析，结果如图5 所示。

图5 不同处理方式对小龙虾虾仁气味的影响Fig.5 Effects of different treatment methods on smell of Procambarus clarkii shrimp

PCA 可以将多重数据降维，对样本的多个指标简化为二维数据进行分析，一般PC1 与PC2 的和不低于85%，即认为可以代表样品指标的主要信息[14]。由图5可知，PC1 与PC2 的总贡献率为92.8%，说明该分析结果具有代表性，能够表征新鲜虾仁、对照组、300 W、0.5%+300、1.0%+600 5 组样品的气味。图中每个处理组所处的位置以及不同组之间的距离可以代表其差异性。从图5 可以看到，对照组与新鲜虾仁气味明显，主要是长时间的加热，挥发性物质损失较多，脂肪与蛋白氧化严重[26]，而300 W 和0.5%+300 处理组则与新鲜虾仁的气味较为接近，不过1.0%+600 处理组与新鲜虾仁的差异相对明显，推测是肌肉蛋白质的过度降解，产生了游离氨基酸等风味物质，对虾仁的气味造成了影响。

2.7 不同处理方式对小龙虾虾仁肌原纤维蛋白含量及蛋白酶酶活力的影响

肌原纤维蛋白是小龙虾虾仁的重要营养成分，加热、超声波以及蛋白酶都可能会影响肌原纤维的结构，引起肌原纤维蛋白的变性和降解。不同处理方式对小龙虾虾仁肌原纤维蛋白含量及蛋白酶酶活力的影响如图6 所示。

图6 不同处理方式对小龙虾虾仁肌原纤维蛋白含量及蛋白酶酶活力的影响Fig.6 Effects of different treatment methods on myofibrillar content and protease enzyme activity of Procambarus clarkii shrimp

由图6 可知，对照组的肌原纤维蛋白含量显著低于其他处理组，说明4 min 的热处理对肌原纤维蛋白造成了严重破坏，虾仁的营养品质下降严重。单独的碱性蛋白酶处理或者超声波处理，则对肌原纤维蛋白含量影响不大，但是由于碱性蛋白酶-超声波联合处理能够促进肌原纤维蛋白的降解，肌原纤维蛋白含量低于单独的碱性蛋白酶或者超声波处理组，不过0.5%+300 组与单独超声波和碱性蛋白酶处理组差异不显著，而1.0%+600 处理组的肌原纤维蛋白含量则显著降低，原因是蛋白质的过度水解，综上所述，采用1 min热烫能够有效保留虾仁的肌原纤维蛋白。高浓度的蛋白酶结合高强度的超声波处理对肌原纤维、线粒体等造成破坏[27]，有可能造成肌原纤维蛋白的进一步降解而造成营养损失。

为了探索碱性蛋白酶-超声波联合处理促进脱壳的机理，对所有处理组的蛋白酶活力进行检测。超声对蛋白酶存在两种效应：促进酶活或者导致酶结构改变而失活。由图6 可知，超声没有提高碱性蛋白酶的活力，反而使酶活性有了一定程度的下降，特别是1.0%+600 处理组相对于1.0%+300 处理组，酶活力下降了约12%。另外，对照组和单独超声处理未发现蛋白酶活性，说明超声和加热均不会诱导内源性蛋白酶的活性。因此，超声-蛋白酶促进小龙虾的壳肉分离，其主要原因应该是超声首先导致外壳与肌肉产生缝隙，使碱性蛋白酶与壳肉连接组织充分接触，促进了连接组织蛋白质的降解。

3 结论

相对于现行传统处理方式，在减少热烫时间的同时，采用碱性蛋白酶和超声波联合处理，能有效降低壳分离功，提高虾仁的完整率和得率，保留较高的肌原纤维蛋白含量，并改善虾仁的嫩度和表面色泽，而过高的酶浓度和超声功率则会造成营养流失和质构劣变。因此，克氏原螯虾热烫1 min 后采用0.5% 碱性蛋白酶和300 W 超声波联合处理，可提高虾仁品质，降低壳肉分离的难度，为克氏原螯虾的加工工艺优化提供理论依据和技术支持。