石墨烯介导铁还原菌耦合针铁矿体系降解四氯化碳

刘乔丹， 李 辉， 刘勇弟

（1.华东理工大学资源与环境工程学院, 上海 200237；2.上海大学环境与化学工程学院, 上海 200444）

铁呼吸是生态系统中常见的一类微生物代谢方式。铁还原菌可以通过呼吸作用在厌氧条件下氧化自身的基质，然后把电子转移至细胞外的三价铁氧化物并将其还原为二价铁，铁还原菌可以从反应中获取能量从而进行代谢生长[1-2]，而高价铁氧化物被还原后容易在其表面形成吸附态的Fe(ⅠⅠ)[3]，吸附态Fe(ⅠⅠ)容易与其他离子反应生成次生铁矿，这些次生铁矿有较高的氧化还原电位，容易对氯代有机物进行降解[4-7]。作为常见的氯代有机物，四氯化碳由于使用范围广、不易自然降解、毒性强、且容易在土壤和地下水中留存，因而对人体健康以及生态系统造成影响。而利用微生物修复技术降解地下水中的氯代有机物是一种可应用于原位修复、二次污染较少的技术[8]，目前对于铁还原菌的铁还原体系还原降解四氯化碳的研究已有较多相关报道[9-10]。

铁还原菌的还原过程本质上是电子传递[11]，即铁还原菌利用外部碳源等物质将电子传递给胞外电子受体的过程。利用铁还原菌对氯代有机物进行降解的过程包括生物和非生物过程，其中的生物过程，即铁还原菌胞外电子传递的过程和方式是关键步骤[12]。铁还原菌胞外电子传递通常是多种方式并用[13]，胞外电子穿梭体的存在能促进铁还原菌的电子传递效率[14-18]。而石墨烯作为炭基材料，有着极强电学性质和较高的比表面积[19-21]，并且石墨烯表面含有醌类和半醌类的官能团，因此具有较强的接受电子以及给出电子的能力，可作为电子穿梭体提髙电子传递的速度[22-23]。近年来，生物炭等一些炭基材料作为电子穿梭体可以加强铁还原菌还原铁氧化物的机制[24-25]，逐渐被人们研究。然而，目前对石墨烯材料作为铁还原菌和铁氧化物电子穿梭体机制的研究比较缺乏。

本文以四氯化碳为对象，研究石墨烯介导铁还原菌耦合针铁矿体系在还原脱氯过程中的作用，从污染物反应动力学、石墨烯介导作用机制出发，研究石墨烯介导铁还原菌耦合针铁矿体系还原四氯化碳的效果和机理。

1 实验部分

1.1 原料和试剂

双氧水（H2O2），w=30%，上海凌峰化学试剂有限公司；四氯化碳（CCl4），分析纯，国药集团化学试剂上海有限公司；戊二醛，分析纯，北京百灵威科技有限公司；还原氧化石墨烯（rGO），分析纯，上海中科纳米有限公司；氧化石墨烯（GO），分析纯，上海中科纳米有限公司；铁还原菌Shewanella putrefaciensCN32(CN32)，中国海洋微生物菌种保藏管理中心。

1.2 实验仪器

恒温培养箱，BPC-250F，上海一恒科学仪器有限公司；真空冷冻干燥机，CY0-0.4，北京惠诚佳仪科技有限公司；X 射线电子能谱仪（XPS），ESCALAB 250XⅠ，赛默飞世尔科技公司；傅里叶红外光谱仪，Nicolet 6700，赛默飞世尔科技公司；X 射线衍射仪（XRD），D/Max-2550PC，日本株式会社理学公司；气相色谱仪，GC-2014C，岛津（中国）有限公司；紫外/可见分光光度计，UV-1800，岛津（中国）有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 不同石墨烯的制备与表征

（1）石墨烯的改性。用双氧水对rGO 粉末进行处理，具体步骤：将0.5 g rGO 粉末添加至30 mLw=30% H2O2的溶液中，在烧杯中搅拌15 h，然后在烘箱中于90 ℃下加热45 min。冷却洗净后，在转速7 500 r/min 条件下离心8 min，去掉上清液，用冷冻干燥机干燥后备用，并命名为rGO（H2O2）。

（2）石墨烯的表征。采用傅里叶红外光谱仪对3 种不同石墨烯的官能团种类进行分析；采用XPS定量分析3 种石墨烯不同官能团的含量以及不同元素的价态。采用比表面仪测定3 种石墨烯的比表面积和粒径等物理参数。

1.3.2 石墨烯初始浓度的确定 在110 mL 血清瓶中分别加入2、4、10 mL 质量浓度为0.5 g/L 的rGO，在反应体系中加入30 mmol/L 乳酸钠、3 mL CN32 菌液、0.5 g 针铁矿以及20 mmoL 的N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸（HEPES）作生物缓冲剂以维持体系pH在7.0 左右，最后通入无菌氮气使体系保持厌氧状态。将血清瓶置于30 ℃、150 r/min 的恒温摇床中反应。设置2 个对照组，一组只加入相同菌种及针铁矿（控制组1），另一组是加入相同菌种和针铁矿后经过高温灭菌的空白对照（控制组2）。

1.3.3 石墨烯对铁还原体系的影响与电化学表征

（1）石墨烯对铁还原体系的影响。使用110 mL棕色血清瓶为反应容器，反应体系为30 mmol/L 乳酸钠、3 mL CN32 菌液、0.5 gα-FeOOH、2.5 mL 20 mg/L 的3 种石墨烯（GO，rGO，rGO（H2O2））。然后加入20 mmol的HEPES 和无菌无机盐培养基以便将体系的pH 维持在7.0 左右，最后通入无菌氮气使体系处于厌氧条件。密封避光置于30 ℃、150 r/min 的恒温摇床中反应，对照组设置情况同1.3.2 节。定期用针筒取样，采用比色法测定溶液中溶解态Fe(ⅠⅠ)浓度以及总Fe(ⅠⅠ)浓度，并以总Fe(ⅠⅠ)浓度减去溶解态Fe(ⅠⅠ)浓度得到体系中吸附态Fe(ⅠⅠ)的浓度。

（2）铁还原生成次生铁矿的分析。反应结束后，将血清瓶中液体离心后冷冻干燥，采用XRD 分析石墨烯耦合铁还原反应后的铁氧化物的晶体形态以及是否有新的次生铁矿产生。

（3）石墨烯电子交换容量的测定。不同炭基材料的电子交换容量（EEC）主要是由材料表面拥有的氧化还原基团数量决定的，包括苯醌、羟基醌、羧基和酚基[26]，其中最主要的是醌基。通过介导电化学还原(MER)和介导电化学还原氧化(MEO)方法，测定石墨烯表面基团的氧化还原能力，从而在一定程度上表征不同石墨烯的电子转移能力。

通过电流计时法分别获得石墨烯氧化态及还原态的电流（I）-时间（t）曲线，并通过式（1）和式（2）计算不同石墨烯的电子接受容量（EAC）和电子供给容量（EDC）：

其中：Ired为基线校正后的氧化还原电流，A；F为法拉第常数，96 485.3 C/mol；m为加入的石墨烯的质量，g。

石墨烯还原态的电流-时间曲线和氧化态的电流-时间曲线的测定方法为：先将5 mLGO 超声分散，制备成GO 悬浮液，并取0.5 mL 加入到玻璃皿中，然后加入PBS（0.1 mol/L Na3PO4，0.1 mol/L KCl，pH=7.0），并通氮气去除溶液中氧气。将电化学工作站与三电极连接，打开时间电流模式，并将工作电极的电位设置为−0.55 V(vs.SHE，SHE 即标准氢电极)，分别以相同步骤再次测定rGO 和rGO(H2O2)的电流-时间曲线。测定氧化态的电流-时间曲线时，将工作电极电位设置为+0.71 V，其余步骤相同。

1.3.4 石墨烯对耦合体系降解四氯化碳的影响 脱氯实验使用110 mL 棕色血清瓶，体系内含30 mmol/L乳酸钠、3 mL 的CN32 菌液、0.5 g 针铁矿，体系内GO、rGO、rGO(H2O2) 3 种石墨烯质量浓度均为20 mg/L，CCl4的浓度为40 μmol/L，加入20 mmoL 的HEPES和无菌无机盐培养基以便将体系的pH 维持在7.0 左右，最后通入无菌氮气使体系处于厌氧条件。密封避光放于30 ℃、150 r/min 的恒温摇床中反应，设置2 个对照组，一个为不加入石墨烯但加入相同菌种及针铁矿的等条件对照组，另一个为不加针铁矿和石墨烯但加菌种的条件对照组。采用气相色谱仪测定样品中的四氯化碳浓度。

2 结果与讨论

2.1 不同石墨烯的官能团表征

图1 为GO、rGO、rGO(H2O2) 3 种石墨烯的红外光谱图。由图可知在3 425 cm−1处不同石墨烯均有较宽的吸收峰，表明石墨烯表面均含有羟基官能团。在1 660 cm−1处3 种石墨烯均显示有C＝ O 官能团的峰出现，其中rGO 的峰值最大，而在1 097 m−1处出现的吸收峰代表的是石墨烯中C−O 键产生的振动。rGO(H2O2)相比于rGO，C＝ O 键和C−O 键的峰值降低了，表明rGO(H2O2)的碳氧官能团含量相对减少。

图1 不同石墨烯的红外光谱图Fig.1 FT-ⅠR Spectra of different prepared graphene

研究表明石墨烯的电子转移能力与其C/O 质量比相关[27]。采用XPS 进一步验证不同石墨烯表面官能团的结构，不同石墨烯的C1s 图谱测试结果如图2 所示。可以看出在284.12、284.55、285.61、286.05 eV 处分离出4 种主要的官能团的峰，分别对应石墨烯上的C＝ C、C−C/C−H、C−O 以及C＝ O键。表1 所示为不同石墨烯官能团质量分数及理化性质的对比。由表1 可知，相比于rGO，rGO(H2O2)中C＝ C 键的质量分数降低，且C＝ O 键的质量分数也相应减少，表明经双氧水处理的rGO 中的碳氧官能团含量减少；rGO 的比表面积最大，表明其有较强的吸附性能。

表1 不同石墨烯的官能团质量分数及理化性质Table 1 Mass fraction of functional groups and physicochemical properties of different graphenes

图2 不同石墨烯的C1s 图谱分析Fig.2 C1s scan spectra for different GOs graphene

2.2 石墨烯初始质量浓度的确定

研究表明石墨烯对CN32 等铁还原菌会产生一定程度的毒性影响，而不同石墨烯对铁还原菌的毒性影响类似[28]。以rGO 为例，研究不同质量浓度对铁还原过程的影响，结果如图3 所示。根据图3 可知，当rGO 质量浓度为20 mg/L 时，rGO 对针铁矿的还原速率最大。当rGO 质量浓度增大到50 mg/L时，还原速率反而降低了，这表明高质量浓度的rGO不利于CN32 铁还原过程的进行。因此，选取质量浓度为20 mg/L 的不同石墨烯进行后续的铁还原实验。

图3 rGO 质量浓度对铁还原过程的影响Fig.3 Effect of the rGO mass concentration on iron reduction process

2.3 石墨烯介导铁还原菌还原针铁矿过程解析

2.3.1 石墨烯促进铁还原菌还原针铁矿 图4 所示为不同石墨烯介导的铁还原体系在反应周期内吸附态Fe(ⅠⅠ)浓度以及总Fe(ⅠⅠ)浓度的变化。从图4 中可以看出：石墨烯的加入显著提高了CN32 的铁还原效率，实验条件下：加入了20 mg/L GO、rGO 和rGO（H2O2）的反应体系在反应结束后总Fe(ⅠⅠ)浓度分别为0.72±0.05、1.17±0.02 、0.79±0.07 mmol/L，说明rGO的促进效果最好，GO 最弱，而rGO（H2O2）的促进效率相比rGO 降低了约32.5%（（1.17−0.79）/1.17×100%），且对比图4（a）和图4（b）可知，不同体系中吸附态的Fe(ⅠⅠ)浓度均占总Fe(ⅠⅠ)浓度70%左右。

图4 石墨烯介导下耦合体系生成Fe(ⅠⅠ)浓度变化Fig.4 Changes of Fe (ⅠⅠ) concentration in graphene mediated coupling system

2.3.2 铁还原菌还原针铁矿生成次生铁矿分析 图5所示为有/无石墨烯介导情况下铁还原菌还原针铁矿后材料的XRD 图谱。可以看出在无石墨烯加入的情况下，针铁矿经过铁还原菌还原后生成了绿锈，其XRD 图谱在11.78°，23.67°有特征峰出现。由于实验体系中含有硫酸根，且绿锈中的铁化合价包括二价铁以及三价铁两种类型[6]，因此推测得到的绿锈化学结构式为；石墨烯耦合体系下针铁矿经过铁还原菌还原后，在10.95°、14.09°、20.05°有特征峰出现，表明生成了蓝铁矿。蓝铁矿主要成分为八水合磷酸亚铁。由于实验体系中含有磷酸根，因此推测溶液中的吸附态Fe(ⅠⅠ)可能与磷酸根共沉淀产生了蓝铁矿。

图5 铁还原菌还原针铁矿后材料的XRD 图谱Fig.5 XRD pattern of the materials after reduction of goethite by ferric reducing bacteria

2.3.3 铁还原过程电化学分析 EAC 和EDC 之和即为物质的EEC，EEC 越大，则该物质的氧化还原活性越大[26]。图6 所示为采用计时电流法测定不同石墨烯的EAC 和EDC 的值。由图6 可以得出，rGO 的氧化还原活性最大，其EEC 值为300.37 μmol/g，而rGO（H2O2）的EEC 值为210.95 μmol/g，相比rGO 降低了29.8%。表明双氧水的处理会破坏rGO 的一部分醌类基团导致其EDC 和EAC 下降；GO 的氧化还原活性最小，表明其表面含氧官能团中醌类基团数量占比较低，与结构表征的结果一致。

图6 计时电流法测定石墨烯的EDC 和EACFig.6 EDC and EAC of the graphene tested by chronoamperometry

2.4 石墨烯介导铁还原菌耦合针铁矿降解四氯化碳

2.4.1 石墨烯对铁还原菌耦合针铁矿降解四氯化碳的影响 图7 所示为不同石墨烯介导铁还原菌耦合针铁矿降解四氯化碳动力学。由图可知，当只有铁还原菌时在反应期内四氯化碳的浓度几乎没有降低，说明单独铁还原菌很难降解四氯化碳；铁还原菌耦合针铁矿的还原体系相比只有铁还原菌的对照组，四氯化碳降解率（实验在第40 d 结束时，四氯化碳浓度变化与其初始浓度的比值）提高了2.87%，表明铁还原菌耦合针铁矿体系对四氯化碳有一定的降解作用；在加入石墨烯的体系中，四氯化碳的降解效果显著提高，其最终降解率在37.5%～92.5%之间。从图4 铁还原过程中的吸附态Fe(ⅠⅠ)浓度以及2.3.2节中次生铁矿的生成可以推测，石墨烯能够加快铁还原体系降解四氯化碳的主要原因是形成脱氯活性较强的次生铁矿，即蓝铁矿。

图7 石墨烯介导下耦合体系降解四氯化碳动力学Fig.7 Degradation dynamics of CCl4 by graphene mediated coupling system

图8 所示为脱氯反应的主要中间产物三氯甲烷浓度随时间的变化曲线，由图可知，三氯甲烷浓度存在最大值，表明四氯化碳的脱氯过程是逐步进行的，即首先脱氯生成三氯甲烷，三氯甲烷再进一步进行脱氯反应。GO 介导的耦合体系中产生的三氯甲烷浓度最低，最高浓度约为15 μmol/L；rGO 介导的耦合体系中产生三氯甲烷的浓度最高，最高浓度约为31 μmol/L；rGO（H2O2）介导的耦合体系中产生的三氯甲烷最高浓度介于两者之间，约为26 μmol/L。三氯甲烷产生的浓度与2.3.1 节不同石墨烯介导的耦合体系下产生的吸附态Fe(ⅠⅠ)浓度相对应，表明该体系下产生的吸附态Fe(ⅠⅠ)能一定程度上促进四氯化碳的降解。

图8 石墨烯介导下耦合体系降解四氯化碳生成三氯甲烷的浓度曲线Fig.8 Concentration curves of CHCl3 generated from CCl4 degradation in graphene mediated coupling system

表2 所示为四氯化碳降解动力学方程的拟合参数。由表2 可知，在rGO 介导的铁还原菌耦合针铁矿还原体系下，kobsCT（准一级速率常数）为（0.965±0.004） d−1，约为无石墨烯对照组kobsCT值（0.065±0.006）的14.8 倍。表明石墨烯能有效提高铁还原菌还原针铁矿降解四氯化碳的速率。

表2 四氯化碳降解动力学方程的拟合参数Table 2 Fitting parameters of CCl4 degradation kinetic equation

图9 所示为石墨烯的EEC 与四氯化碳kobsCT的相关性分析。由图可知，不同石墨烯的电子转移能力即氧化还原能力与kobsCT值具有很好的线性相关性（R2=0.98），表明石墨烯表面的氧化还原活性官能团数量可能是影响其作为铁还原菌胞外电子穿梭体能力的主要因素。

图9 准一级速率常数与石墨烯电子交换容量的相关性分析Fig.9 Correlation analysis between pseudo-first-order-rate constant and electronic exchange capacity of graphene

2.4.2 石墨烯介导铁还原菌耦合针铁矿还原体系降解四氯化碳机理 图10 所示为石墨烯介导铁还原菌耦合针铁矿还原体系降解四氯化碳的机理。在铁还原体系中，由于石墨烯具有较大比表面积的特性，其表面会吸附大量的铁还原菌和针铁矿，增加了铁还原菌和针铁矿的反应位点和几率。同时石墨烯具有较好的导电能力，其表面的醌基等氧化还原活性基团能以电子穿梭体的形式提高铁还原菌的电子传递效率，从而使得到电子的针铁矿在石墨烯表面还原产生大量的吸附态Fe(ⅠⅠ)。这些吸附态Fe(ⅠⅠ)在还原体系下再与磷酸根结合生成蓝铁矿，而蓝铁矿对氯代有机物有较高的降解活性[29]。产生的蓝铁矿与被吸附在石墨烯表面的四氯化碳发生了脱氯反应，并使其分解成三氯甲基自由基（·CCl3），·CCl3可以从水分子中提取氢生成三氯甲烷，而吸附态的Fe（ⅠⅠ）失去电子后，则重新被氧化为Fe（ⅠⅠⅠ），从而完成铁循环反应。另外从图8 可以看出，在石墨烯介导的3 种耦合体系降解四氯化碳第15 d 时，三氯甲烷的浓度均出现一个最大值，因此推测铁还原体系下一部分·CCl3可能会被继续还原为，而直接通过脱去一个Cl−得到。通过OH−*的连续亲核攻击，可以产生CCl(OH)*和，得到水中OH−后脱水生成甲酸盐产物，而CCl(OH)*通过脱去一个HCl 得到CO[5]。

图10 石墨烯介导铁还原菌耦合针铁矿还原体系降解四氯化碳机理图Fig.10 Mechanism of CCl4 degradation by graphene mediated iron-reducing bacteria coupled with goethite reduction system

3 结 论

（1）在有石墨烯的铁还原菌耦合针铁矿体系中，吸附态Fe(ⅠⅠ)浓度均有所提高，其中rGO 促进程度最大，GO 促进效果最弱，rGO（H2O2）促进效率相比rGO 降低了约32.5%，由表征结果推测体系中生成了具有还原脱氯活性的蓝铁矿。而在未加入石墨烯的铁还原体系中，表征结果表明仅生成了绿锈，说明吸附态Fe(ⅠⅠ)浓度的提高有助于生成污染物降解活性更大的蓝铁矿。

（2）rGO（H2O2）的EEC 值相比rGO 降低了29.8%，表明双氧水的处理会破坏rGO 的一部分醌类基团导致其EEC 值下降。

（3）不同石墨烯均能够作为电子穿梭体提高铁还原菌耦合针铁矿降解四氯化碳的速率，且四氯化碳降解的kobsCT和石墨烯EEC 具有较好的相关性，表明石墨烯表面电子传递速率决定了四氯化碳还原脱氯速率。