卤代甲基转移酶的发现与应用研究进展

陈 琦， 张诗雨， 高春玉， 郑高伟， 许建和

（华东理工大学生物工程学院, 生物反应器工程国家重点实验室, 上海 200237）

烷基化反应在化学合成和生物合成领域中具有重要的地位，通过引入甲基或其他烷基基团，可以调控分子的生物活性和物理化学性质，从而实现目标分子结构和功能的精准设计。S-腺苷甲硫氨酸(SAM)及其依赖性甲基转移酶(MT)体系是生物体内常见的烷基化催化系统。由于甲基转移酶的底物范围十分广泛，它不仅可以催化SAM-甲基的转移，还可以在一定程度上催化SAM 类似物的烷基转移，这种底物混杂性有利于实现天然产物的烷基随机化。由于SAM 及其类似物的成本很高、且相对不稳定，导致其应用范围受限。因此，研究SAM 及其类似物的合成或再生至关重要。

SAM 及其类似物的合成方法包括：化学合成、酶法合成和S-腺苷-L-半胱氨酸(简称SAH)的循环再生。化学法催化SAH 可以生成有活性的(S)-SAM 和非活性(R)-SAM 的异构体混合物。该异构体混合物的分离纯化较困难，且SAH 价格昂贵，因此该合成路线的经济性不高，难以实现工业化应用。SAM 在生物体内的合成主要依赖于S-腺苷甲硫氨酸合成酶(MAT)，它催化L-甲硫氨酸(L-Met)和三磷酸腺嘌呤(ATP)反应，生成SAM 和三磷酸。MAT 也可以催化L-Met 类似物的缩合反应，生成SAM 类似物。化学-酶法生产的非对映体纯SAM 和SAM 衍生物的引入，拓宽了酶催化烷基化反应的范围[1-2]。然而，L-Met 类似物需要通过化学法合成，合成方法相对复杂，且不易分离。2017 年，文献[3]报道了一种基于多聚磷酸盐的甲基转移酶循环再生级联反应，如图1 黑色箭头所示路线。这个仿生的循环再生系统较好地解决了昂贵的SAH 不能直接回收的问题，标志着MT 在生物催化应用方面迈出了重要一步。该方法的主要不足在于系统中包含6 种酶和14 种代谢物，综合成本过高，难以实现规模化应用。

图1 SAM 的原位循环再生反应系统Fig.1 The in-situ recycling regeneration reaction system of SAM

2019 年，Seebeck 团队[4]通过引入卤代甲基转移酶(HMT)催化SAH 合成SAM，报道了一种更加简单、通用的SAM 循环再生系统。HMT 除了可以同普通甲基转移酶一样产生甲基化产物外，还可以实现从SAH 到SAM 的直接再生。将HMT 与MT 级联，并使用甲基碘(Met-I)作为SAH 的甲基供体，如图1 红色箭头路线所示，就能实现简单的体外甲基化级联反应。该体系可以实现高达500 多次的SAH 循环，比仿生级联系统更加简单、高效，为生物催化的烷基化反应提供了新的策略。为了突破甲基供体碘甲烷有毒且易挥发的问题，2022 年Seebeck 团队[5]发现了来自硫嘌呤甲基转移酶家族的酶(TPMT)，它能接受基于硫酸酯和磺酸酯的甲基供体，且其转化SAH 生成SAM 的效率可与先前发表的利用碘甲烷的生物转化过程相媲美。随后，Hammer 团队[6]利用TPMT 家族的酶参与不饱和杂环的选择性N-甲基化，可用于形成N-杂环的C−N 键，直接将有生物活性的先导结构烷基化为各种潜在的、具有更高活性的烷基化衍生物，同时大大缩短了合成工艺路线。

为了实现更长链烷基的转移，2021 年Bornscheuer团队[7]报道了以碘化物为甲基供体的拟南芥卤代甲基转移酶(AtHMT)的定向进化研究，所得突变体V140T 可以接受乙基、丙基和烯丙基的碘化物，并产生相应的SAM 类似物。他们还将AtHMT-V140T 与O-甲基转移酶应用于一锅级联反应中，实现了木犀草素的区域选择性乙基化和3,4-二羟基苯甲醛的烯丙基化。为了进一步提高HMT 催化生成长链烷基转移的效率，本课题组[8]采用半理性设计和基于结构-功能关系分析的定向进化方法，对棒曲霉卤代甲基转移酶(AcHMT)进行了分子改造，使其能够更好地接受碘乙烷(EtI)，催化合成S-腺苷乙硫氨酸(SAE，为SAM 的乙基类似物)。筛选所得最优突变体AcHMT-M3 对EtI 的比活力(421.5 mU/mg)比野生型AcHMT 的比活力(10.88 mU/mg)提高了38 倍，比Bornscheuer团队报道的最佳变体AtHMT-V140T 的比活力 (25.82 mU/mg)高出16 倍。最后，以3,4-二羟基苯甲醛(3,4-DHBAL)为底物，采用AcHMT-M3 和O-甲基转移酶(RnCOMT-Y200L)进行一锅级联反应，如图2 所示，成功实现了乙基香兰素(Ethyl vanillin)的生物合成，证实了工程化的HMT 在生物催化实现化合物的乙基化修饰方面的巨大应用潜力。

图2 AcHMT-M3 和COMT 级联催化3,4-DHBAL 一锅法合成乙基香草醛[8]Fig.2 AcHMT-M3 and COMT catalyzed the one-pot synthesis of ethyl vanillin by 3,4-DHBAL[8]

卤代甲基转移酶HMT 的发现及其与MT 的级联应用研究，为生物催化的烷基化反应提供了新的研究思路。利用HMT 的底物混杂性，不同的烷基卤化物均有可能作为烷基供体用于SAM 及其类似物的酶促合成，从而实现酶催化的烷基转移。最新的研究以磺酸类物质作为新的甲基供体，在硫嘌呤甲基转移酶家族成员的催化下实现SAM 再生，相较于卤化物更加绿色环保。HMT-MTs 的级联催化不仅实现了SAM 及其类似物的酶法合成和原位再生，也提高了反应的原子经济性，使得烷基化反应更加简单、高效。然而HMT 对于长链或者更复杂的烷基供体的催化活力尚较低，使得它目前还无法满足实际工业应用的需求。因此对这类酶进行催化机理解析、结构改造以及新的同系酶挖掘将成为未来的研究热点。通过HMT 和HMT-MT 级联反应的更深入研究，可望获得能接受新型非天然烷基供体的独特酶催化剂，从而实现更多种化合物的高效生物烷基化，助力绿色生物制造的技术变革。