低温等离子体耦合微酸性电解水对三文鱼的保鲜作用

朱文慧，谭桂芝，2，步 营，李学鹏，励建荣*，崔方超，檀茜倩，孟玉琼，马 睿，郭晓华

（1 渤海大学食品科学与工程学院 辽宁省高校重大科技平台“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”辽宁锦州121013 2 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 大连工业大学 辽宁大连116034 3 青海大学 西宁810016 4 山东美佳集团有限公司 山东日照 276800）

三文鱼被誉为“水中珍品”，营养丰富，在世界各地备受欢迎。然而，在加工、贮藏运输及销售过程中新鲜三文鱼很容易被微生物污染，从而导致其新鲜度变差，营养价值降低或腐败变质[1]。微生物增殖是造成三文鱼腐败变质的主要原因，因此迫切需要找到能有效灭活三文鱼体的微生物，并能保持其良好品质的方法。热处理虽可以杀死微生物，但会对食品的物理化学性质及感官品质产生不良影响；而高压二氧化碳、超声波、冷等离子体、电子束辐照和脉冲电场技术等非热食品加工技术既可以灭活微生物，延长保质期，又能最大程度上保持肉的良好品质属性[2]。

近年来，低温等离子体（Cold plasma，CP）已成为国内外食品冷杀菌的研究热点。低温等离子体中产生的多种活性物质，如羟自由基、过氧化氢、活性氧和活性氮等是导致微生物失活的主要原因[3]。然而，低温等离子体技术不能对产品表面进行均匀处理[4]，产生的活性物质也会加速脂质氧化[5]。低温等离子体装置通过在水表面或水面下进行等离子体放电，就可以制出等离子体活化水（Plasma activated water，PAW），当CP 与不同液体介质相互作用时，会发生各种复杂的化学反应，导致反应物种的产生，处理溶液的pH 值、氧化还原电位和电导率等物理化学性质会发生巨大变化[6]。与传统的低温等离子技术相比，PAW 具有灵活、安全等优点，能对产品表面进行均匀杀菌处理，目前已广泛应用于肉、新鲜农产品和鱼等产品中[7]。微酸性电解水（Slightly acidic electrolyzed water，SAEW）是通过电解氯化钠溶液或稀盐酸溶液而产生的一种新型的消毒剂[8]，具有强杀菌能力，低成本，方便制取等特点，被广泛用于鸡蛋、肉类、水果和水产品等的杀菌[9]。于福田等[10]研究发现有效氯质量浓度为35.00 mg/L、浸泡时间为22 min、料液比为1∶6 时，微酸性电解水对新鲜罗非鱼片的杀菌率为（81.59±0.04）%，且对品质的影响最小。另一些研究表明，微酸性电解水可以促进脂肪氧化和蛋白质氧化，这可能与其所含的活性物质（HOCl，Cl2和OCl-）的浓度有关[11]。对于非热杀菌技术，如何在保证高杀菌效果的前提下，有效防止产品的脂肪氧化和蛋白氧化，是迫切需要解决的问题。

本研究以菌落总数为指标，通过单因素实验和响应面试验优化低温等离子体耦合微酸性电解水对三文鱼的最佳杀菌条件，并对比研究等离子体活化水、微酸性电解水及低温等离子体耦合微酸性电解水对三文鱼冷藏期间的抑菌效果、脂肪氧化、蛋白质氧化及品质变化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三文鱼，山东日照鼎好食品有限公司。通过冷链运输至实验室于-80 ℃冷藏。平板计数琼脂，青岛海博生物技术有限公司。氯化钠、硫代硫酸钠、丙二醛、碘化钾、三氯乙酸、无水乙醇等试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

TS-APJ03 低温喷射等离子体，深圳市东信高科自动化设备有限公司；微酸性电解水发生器，丹麦DCW 公司；PHS-3C pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；K9840 海能凯氏定氮，海能未来技术集团股份有限公司；CR-400 色差计，日本Konica-Minol-ta 公司；UV-2550 紫外-可见分光光度计，日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 单因素条件对杀菌效果的影响 室温条件下，以菌落总数为指标，以功率（160，220，300，380 W），活化时间（1，3，5，7 min），料液比（1∶2，1∶4，1∶6，1∶8），浸泡时间（5，10，15，20，25 min），有效氯质量浓度（10，20，30，40，50 mg/L）为单因素，考察不同条件下低温等离子体耦合微酸性电解水对杀菌效果的影响。

1.3.2 响应面法优化低温等离子体耦合微酸性电解水杀菌效果的试验设计 利用Design-Expert 10.0 软件上的Box-Behnken 功能模块，在单因素实验结果的基础上进行了响应面优化设计，以活化时间、低温等离子体功率、浸泡时间为因变量，菌落总数为响应值，试验因素和水平如表1 中所示。

表1 Box-Behnken 试验因素水平Table 1 Box-Behnken test factors and levels

1.3.3 低温等离子体耦合微酸性电解水（PASW）的制备和样品处理

1.3.3.1 PAW 的制备 大气压等离子体射流在冰水浴中活化蒸馏水（400 mL）。

1.3.3.2 SAEW 的制备 由DCW 微酸性电解水发生器制备，其中SAEW 的pH 值、氧化还原电位和有效氯质量浓度分别为6.09，810 mV 和50 mg/L。

1.3.3.3 PASW 的制备 大气压等离子体射流在冰水浴中活化SAEW（400 mL）。

1.3.3.4 样品前处理 将三文鱼浸没在含有不同溶液（PAW、SAEW、PASW）的无菌袋中，置于4 ℃冰箱贮藏，分别记为PAW、SAEW、PASW 处理组，PASW 处理组按照响应面最优结果处理，SAEW与PAW 的处理条件与PASW 一致，新鲜三文鱼设为对照组。

1.3.4 菌落总数测定 按照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》中的方法测定。

1.3.5 pH 值测定 参考GB 5009.237-2016 《食品安全国家标准 食品pH 值的测定》中的方法测定。

1.3.6 TVB-N 测定 参考GB 5009.228-2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》中的方法测定，样品中TVB-N 含量（X）按照下式计算[12]。

式中，V1——样品消耗盐酸体积，mL；V2——空白消耗盐酸体积，mL；m——样品质量，g；c——盐酸浓度，mol/L。

1.3.7 TBARS 值和羰基测定 TBARS 值和羰基含量参考Zhu 等[13]的方法测定。

1.3.8 色差测定 取适量的鱼片用色差计进行检测并读取L*、a*、b*值。每组做6 次平行。

1.3.9 数据处理与分析 数据采用SPSS 19.0 软件进行显著性分析，多重比较采用Duncan 检验。响应面模型拟合采用Design-Expert 10.0 软件统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

以浸泡时间20 min、料液比1∶6、有效氯质量浓度50.00 mg/L 和功率300 W 为条件进行实验，研究了不同活化时间处理对菌落总数（Total viable count，TVC）的影响。如图1a 所示，随着活化时间的延长，TVC 逐渐减 少，3 min 和5 min 时TVC 差异不大，在5～7 min 时变化比较平缓。因此，选取5 min 为0 水平进行响应面试验。

图1 活化时间（a）、功率（b）、浸泡时间（c）、有效氯质量浓度（d）、料液比（e）对三文鱼菌落总数的影响Fig. 1 Effects of activation time（a），power（b），soak time（c），available chlorine concentration（d），solid-liquid ratio（e）on total viable counts of salmon

以料液比1∶6、有效氯质量浓度50.00 mg/L、浸泡时间20 min，活化时间5 min 进行实验，研究不同低温等离子体活化功率影响结果。如图1b 所示，经不同功率处理的三文鱼的TVC 明显少于对照组，且随功率的增加，TVC 显著降低，当功率为300 W 时，TVC 减少了0.93 lg（CFU/g），当功率为380 W 时，TVC 减少了1.00 lg（CFU/g）。因此，选取300 W 为0 水平进行响应面试验。

以料液比1∶6、功率300 W、有效氯质量浓度50.00 mg/L、活化时间5 min 进行实验，研究不同浸泡时间影响。结果如图1c 所示，随着浸泡时间的延长TVC 逐渐减少，在0～5 min TVC 的量明显降低，而在5～20 min 变化比较平缓，在浸泡时间为20 min 时，细菌总数减少了0.95 lg（CFU/g），在浸泡时间为25 min 时，TVC 减少了1.17 lg（CFU/g）。因此，20 min 为0 水平进行响应面试验。

以料液比1∶6、浸泡时间20 min、功率300 W、活化时间5 min 进行实验，研究不同有效氯质量浓度的影响。结果如图1d 所示，随着有效氯质量浓度的不断增加，鱼肉中的TVC 不断减少，在有效氯质量浓度为10～40 mg/L 时TVC 变化不明显，可能是因为在等离子体的激发过程中对微酸性电解水中的活性物质产生了一定的消减。有研究表明随着微酸性电解水有效氯浓度的增大，会对鱼肉的颜色产生一定的影响。在本试验中有效氯质量浓度为50.00 mg/L 时，未发现低温等离子体活化微酸性电解水对三文鱼颜色有影响，因而选择有效氯质量浓度为50.00 mg/L 进行后续试验。

以活化时间5 min、功率300 W、浸泡时间20 min、有效氯质量浓度50.00 mg/L 进行实验，研究不同料液比的影响。如图1e 所示，随料液比量的不断增大，鱼肉的TVC 逐渐减少（P<0.05），当料液比为1∶6 和1∶8 时，TVC 分别减少了0.67 lg（CFU/g）和0.98 lg（CFU/g）。随着料液比的增大，鱼片可充分地与活化水接触，从而有助于减菌，而比例增大会对导致三文鱼产生一定的褪色，因而选择1∶6 进行后续试验。

2.2 Box-Behnken 试验结果分析

2.2.1 模型建立与方差分析 低温等离子体耦合微酸性电解水杀菌Box-Behnken 试验结果如表2所示，对表2 中的数据进行分析，得到二次多项式拟回归方程：Y=2.91 -0.09A+0.01B -0.1C -0.03AB+0.07AC+0.01BC+0.15A2-0.04B2+0.13C2（其中，Y：杀菌对数值，A：功率，B：浸泡时间，C：活化时间）。在响应面建模、拟合和优化过程中所产生的误差会影响模型的可行性，当模型中的P<0.05，并且失拟项值>0.05 时证明该模型可行[14]。由表3 可知，试验模型极显著（P<0.01），失拟项P 值为0.173>0.05，不显著，说明该模型与实际情况拟合良好；模型的R2=0.97，R2adj=0.97，证明该模型拟合程度良好，适用于优化菌落总数杀菌效果[15]。

表2 Box-Behnken 试验设计结果Table 2 Box-Behnken test design and results

表3 回归模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression models

由表3 方差分析可知，各因素对菌落总数指标的影响顺序依次为：功率（A）>活化时间（C）>浸泡时间（B）。一次项A、C，二次项A2、C2，交互项AC 对菌落总数影响极显著（P<0.01），交互项AB对菌落总数影响显著（P<0.05）；而浸泡时间（B）、浸泡时间与活化时间（BC）之间的交互性对其响应值影响不显著（P>0.05）。

2.2.2 交互作用分析 图2 为低温等离子体耦合微酸性电解水功率、浸泡时间、活化时间的两两交互项对试验结果的影响图。各因素及其交互作用对TVC 含量的影响可以通过响应面及其等高线图直观的反映出来，响应面图的曲线越陡峭，说明这3 个因素的相互作用就越显著[16]。由图2 可知，功率与浸泡时间（AB）、功率与活化时间（BC）响应面坡度较为陡峭，说明功率与浸泡时间、功率与活化时间之间交互作用大，对试验结果的影响显著；浸泡时间与活化时间的响应面坡度较为平缓，说明浸泡时间与活化时间之间的交互作用对试验结果的影响不显著。

图2 试验因素间的交互作用对三文鱼表面减菌效果的影响Fig. 2 Effect of interaction of experimental factors on the decontamination of salmon surface

2.2.3 回归模型最优解的确定与验证 通过响应面模型优化低温等离子体耦合微酸性电解水杀菌条件，预测得最优参数为：功率318 W，浸泡时间19.33 min，活化时间5.44 min。结合实际将模型最优解修正为：功率320 W，浸泡时间20 min，活化时间5 min。在此条件下经过3 次平行试验，试验结果与预测值基本一致（见表4），说明采用响应面优化得到的低温等离子体耦合微酸性电解水处理三文鱼鱼片的杀菌工艺参数准确可靠，具有可行性。

表4 最优条件下的预测值及实际值Table 4 The predicted and experimental values under the optimum process conditions

2.3 低温等离子体耦合微酸性电解水处理对三文鱼贮藏期间TVC 的影响

PASW 处理对三文鱼贮藏期间TVC 的影响如图3 所示。由图3 可知，随着贮藏时间延长，各处理组间三文鱼TVC 持续上升；在贮藏初期，对照组的TVC 值为（3.35±0.20）lg（CFU/g），说明样品较新鲜；在贮藏过程中，其它3 组样品TVC 值的增长速度明显比对照组的慢；在第6 天，对照组的菌落总数含量超过了菌落总数的上限值6.00 lg（CFU/g）。一般来说，TVC 值为5.00 lg（CFU/g）表示海鲜产品的新鲜度阈值，TVC 值低于6.00 lg（CFU/g）表示质量可接受[17]。此 外，PASW、SAEW 和PAW 组样品在第8 天的菌落总数为（7.09±0.04）、（7.47±0.09）lg（CFU/g）和（6.98±0.06）lg（CFU/g），说明PAW、PASW 能够显著延缓对三文鱼微生物的生长，这可能是由于低温等离子体产生了丰富的活性物质ROS 或RNS，如H2O2。

图3 不同处理方式下三文鱼菌落总数随贮藏时间的变化Fig. 3 Changes of the total baterial account of salmon with storage time under different treatments

2.4 低温等离子体耦合微酸性电解水处理对三文鱼贮藏期间pH 值的影响

pH 值的变化被认为是反映贮藏过程中理化性质的一个指标[18]。由图4 可知，所有组别样品的pH 值变化趋势基本一致，均呈先降后升的趋势，且各组之间pH 值差异不显著，样品pH 值降低的原因可能与CO2的溶解或乳酸的积累有关；而pH 值升高则与蛋白质等含氮类物质在微生物和内源酶的作用下被分解为胺、三甲胺等挥发性碱有关[19-20]。

图4 不同处理方式下三文鱼pH 值随贮藏时间的变化Fig. 4 Changes of pH value of salmon with storage time under different treatments

2.5 低温等离子体耦合微酸性电解水处理对三文鱼贮藏期间TVB-N 的影响

挥发性盐基氮（TVB-N）被用作检测鱼类新鲜度的重要指标，鱼死后腐败细菌的迅速生长导致含氮化合物分解代谢产生氨从而使TVB-N 值迅速增加[21]。图5 所示，随着贮藏时间的延长，4组三文鱼鱼片的TVB-N 含量值均呈上升的趋势。4 ℃贮藏期间，PAW、SAEW、PASW 组三文鱼TVB-N 含量明显低于对照组，说明PAW、SAEW、PASW 处理能延缓鱼肉腐败变质的程度。贮藏第0 天时，与对照组相比，PAW、SAEW、PASW 组三文鱼TVB-N 含量分别下降3.62，4.39，4.32 mg/100 g，说明贮藏初期PAW、SAEW、PASW 对腐败细菌及内源酶有一定的抑制作用。有研究表明海水鱼TVB-N 的上限值为30 mg/100 g[22]，贮藏至第8 天时，对照、PAW、SAEW、PASW 组TVB-N 值分别为33.36，28.47，29.15，28.23 mg/100 g。其中，对照组的三文鱼已超过食用限度值，达到了腐败程度。结果表明，PAW、SAEW、PASW 可以显著减少三文鱼片中TVB-N 的形成，从而提高了三文鱼的新鲜程度。

图5 不同处理方式下三文鱼TVB-N 含量随贮藏时间的变化Fig. 5 Changes of TVB-N content in salmon with storage time under different treatments

2.6 低温等离子体耦合微酸性电解水处理对三文鱼贮藏期间TBARS 值和羰基含量的影响

脂质氧化是由氢的提取触发的一种自由基链式反应，过氧化氢是第一个稳定的产物，然而过氧化氢分解后可能产生二级脂质氧化产物，如脂质过氧自由基的各种加成、重排或错位反应形成的醛或酮[23]。因此，充分评估脂质氧化并测定脂质过氧化产物显得尤为重要。硫代巴比妥酸反应产物可被用作为衡量脂质过氧化的指标。低温等离子体产生的硝酸盐及亚硝酸盐（RONS）可能在猪肉、牛肉、鸡肉和海鲜等表面引发脂质氧化[24]。三文鱼在贮藏期间TBARS 含量的变化如图6a 所示，随着贮藏期的延长，各组的TBARS 值均呈现上升趋势。PAW 组与SAEW 组的TBARS 值明显高于对照组，而经PASW 处理后的三文鱼TBARS 值最低。TBARS 值为8 mg MDA/kg 通常被认为是鱼类可接受的极限，有研究表明，TBARS 在大于3 mg MDA/kg 时就有明显的酸味[25]。上述数据表明，将三文鱼浸泡在PAW、SAEW 和PASW 中，对三文鱼的TBARS 值产生较小的影响，而且这些值都在可接受的范围内。

图6 不同处理条件下三文鱼TBARS（a）和羰基（b）含量随贮藏时间的变化Fig. 6 Changes of TBARS（a）and carbonyl content（b）of salmon with storage time under different treatments

在蛋白质的变性过程中，蛋白质主链通过α-酰胺化和β-剪断以及脯氨酸、精氨酸、赖氨酸和苏氨酸等氨基酸侧链的直接或间接氧化而发生断裂，从而形成羰基衍生物，羰基含量的增加与蛋白氧化呈正相关[26]。不同处理组的三文鱼鱼片羰基含量的变化如图6b 所示，随着贮藏期的延长，羰基含量逐渐增加，对照组的羰基含量从第0 天的0.21 nmol/mg 增加到第8 天的1.00 nmol/mg。在贮藏初期，各处理组的羰基含量无明显差异（P>0.05），随着时间的延长，可观察到经PAW 与SAEW 处理的三文鱼蛋白氧化程度与对照接近或略高于对照组，而经PASW 处理过的三文鱼羰基含量显著低于对照，说明PASW 组能抑制蛋白的氧化。

2.7 低温等离子体耦合微酸性电解水处理对三文鱼贮藏期间色差的影响

色泽是评价肉制品品质的重要指标之一，它直接影响消费者对其的接受程度[27-28]。其中，L*表示亮暗，+表示偏亮，-表示偏暗；a*表示红绿，+表示偏红，-表示偏绿；b*表示黄蓝，+表示偏黄，-表示偏蓝。经不同杀菌处理的三文鱼在4 ℃贮藏后L*、a*、b*值变化如表5 所示，各处理组之间L*、a*值逐渐增大，而b*没有明显的变化；此外，在贮藏期的前4 d，各处理组之间的L*、a*、b*值差异不显著，至贮藏第8 天，其差异显著。其中，经过PASW处理的L*值为49.45，较对照组（44.42）、PAW 组（48.00）、SAEW 组（46.58）均要大，说明亮度高。经过PASW 处理的a*值为8.85，较对照组（6.57）、PAW 组（7.46）、SAEW 组（7.01）均要大，说明三文鱼片颜色偏红，并且PASW 组红度值最高，颜色最红。

表5 不同处理方式对三文鱼色泽随贮藏时间的变化Table 5 Changes of the color of salmon with storage time under different treatments

肌红蛋白（Mb）存在于肌肉纤维细胞中，是三文鱼体内最重要的色素物质。一般来说，三文鱼肌肉的鲜红色主要与氧合肌红蛋白（OxyMb）有关。在长时间的低温冷冻保存下，OxyMb 极易氧化为棕色的高铁肌红蛋白（MetMb）[29]，从而导致三文鱼的褐变，大大影响其商业价值。三文鱼富含不饱和脂肪酸，因此其在储存过程中特别是随着温度的波动容易发生脂肪氧化[30]。有学者提出脂质氧化和肌红蛋白氧化是相互促进的：一方面铁可以在肌红蛋白变性后从血红素中释放出来，促进脂质氧化；另一方面，脂质氧化的中间产物（如自由基）可以破坏肌肉中的色素，使其易于褐变[31]。在本试验中低温等离子体耦合微酸性电解水组三文鱼颜色最好，也说明低温等离子体耦合微酸性电解水缓解了Mb 氧化，减少了棕色的高铁肌红蛋白生成，这也与低温等离子体耦合微酸性电解水可以缓解脂肪氧化和蛋白氧化的结果相对应。

3 结论

本研究以菌落总数为指标，结合单因素实验和响应面试验，确定功率320 W、浸泡时间20 min、活化时间5 min、有效氯质量浓度为50 mg/mL、料液比为1∶6 为最佳杀菌条件。经等离子体活化水、微酸性电解水及低温等离子体耦合微酸性电解水处理后，研究不同预处理方式对三文鱼冷藏期间抑菌效果、脂肪氧化及品质的影响。结果表明，随着贮藏时间延长，各组样品微生物数量、pH值、TVB-N 值均升高，与其它处理组相比，低温等离子体耦合微酸性电解水处理能明显降低三文鱼鱼片脂肪与蛋白氧化，综合考虑，低温等离子体联合微酸性电解水处理组保鲜效果最佳。较对照组而言，低温等离子体耦合微酸性电解水处理可使三文鱼鱼片冷藏货架期延长2 d。因此，低温等离子体耦合微酸性电解水的前处理方式可有效延长三文鱼的货架期，为水产品冷藏保鲜工业化应用提供新思路。