HPLC 法同时测定舒肝利胆丸中5 种成分的含量

毕映燕，李季文，徐志伟，李俊江

（甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050）

舒肝利胆方由醋柴胡、金钱草、白豆蔻、荆芥、生白芍、郁金、天花粉、麸炒枳壳、紫苏子、白芥子、炙甘草、干姜、大枣等药味组成，诸药合用共奏疏肝利胆、清热祛湿，理气止痛之功，主要用于慢性胆囊炎的治疗。前期为方便患者服用，在保留原物质的基础上拟将其开发为舒肝利胆浓缩丸。

现代药理研究证实，胆囊炎的发病机理与炎症反应、代谢紊乱、胆汁滞留等相关［1］。柴胡中柴胡皂苷具有抗炎，促进胆汁酸排泄的作用［2］，为疏肝利胆药效活性部位。金钱草黄酮类成分具有降低胆汁黏度，促进胆汁流动的作用［3］。紫苏子水溶性酚酸类成分迷迭香酸具有保肝的药理活性［4］。甘草中甘草苷、枳壳中橙皮苷通过发挥保肝、抗炎、调节代谢等作用［5-9］，达到治疗胆囊炎目的。该方在我院以协定处方应用多年，但尚无舒肝利胆方及其制剂的质量控制报道，也未见同时测定柴胡皂苷a、槲皮素、迷迭香酸、橙皮苷、甘草苷含量的研究。因此，本实验建立HPLC 法同时测定上述5 种有效成分的含量，为全面控制舒肝利胆丸质量提供参考。

1 材料

1.1 仪器 PEA10 型高效液相色谱仪（美国珀金埃尔默仪器公司）； HS6150 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； LX 系列电子分析天平（瑞士普利赛斯公司）；HWS26 型电热恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 试剂与药物 舒肝利胆丸 （中试产品，批号20210701、20210802、20210803） 为甘肃省中医院自制。甘草苷（批号111610-201607，纯度98%）、橙皮苷（批号110721-201818，纯度98%）、迷迭香酸 （批号111871-201706，纯度98%）、槲皮素（批号100081-201610，纯度98%）、柴胡皂苷a （批号20736-09-8，纯度98%） 对照品均购自中国食品药品检定研究院。甲醇、乙腈（色谱纯，山东禹王集团化工分公司）； 甲醇（分析纯，天津市博迪化工有限公司）； 磷酸（色谱纯，天津大茂化学试剂厂）；水为实验室自制。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取对照品甘草苷21.60 mg、橙皮苷20.50 mg、迷迭香酸41.20 mg、槲皮素0.80 mg、柴胡皂苷a 21.20 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，得质量浓度分别为甘草苷2.16 mg/mL、橙皮苷2.05 mg/mL、迷迭香酸4.12 mg/mL、槲皮素0.08 mg/mL、柴胡皂苷a 2.12 mg/mL 的溶液，即得，4 ℃保存备用。

2.1.2 供试品溶液制备 将舒肝利胆丸置于研钵中，研成细粉状，取2.0 g，加甲醇20 mL，称定质量，超声（300 W、40 kHz） 提取40 min，室温下放置20 min，甲醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm 滤膜过滤，取续滤液，即得［10］。

2.1.3 阴性样品溶液制备 按处方配比和生产工艺，分别制备缺醋柴胡、缺金钱草、缺枳壳、缺紫苏子、缺甘草的阴性样品，按“2.1.2” 项下方法制备，即得。

2.2 色谱条件 Waters Symmetry Shield 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）； 流动相乙腈（A） -0.1% 磷酸（B），梯度洗脱（0～12 min，17% A； 12 ～18 min，17% ～22% A；18～24 min，22% ～30%A； 24～32 min，30% ～38%A； 32 ～45 min，38% ～80%A； 45～55 min，80% ～17%A）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温20 ℃； 检测波长0 ～18 min 237 nm（甘草苷），18 ～24 min 283 nm （橙皮苷），24 ～28 min 330 nm （迷迭香酸），28 ～35 min 368 nm （槲皮素），35 ～55 min 210 nm （柴胡皂苷a）； 进样量10 μL［11-13］。

2.3 系统适用性考察和专属性试验 精密吸取对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.2” 项色谱条件下进样测定。结果，供试品溶液中甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 保留时间与对照品溶液中一致，与相邻色谱峰分离度大于1.5，阴性无干扰，理论塔板数以甘草苷计不低于4 000，见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.1” 项下对照品适量，甲醇逐级稀释成系列质量浓度，在“2.2” 项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积（Y） 对其质量浓度（X） 进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.5 精密度试验 取对照品溶液适量，在“2.2” 项色谱条件下进样测定6 次，测得甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 峰面积RSD 分别为1.02%、0.85%、0.62%、0.93%、1.16%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取供试品溶液（批号20210701） 适量，于0、4、8、12、18、24 h 在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a峰面积 RSD 分别为1.85%、0.95%、1.17%、0.93%、1.16%，表明溶液在24 h 内稳定性良好［14］。

2.7 重复性试验 取本品 （批号20210701） 适量，按“2.1.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，测得甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 峰面积RSD 分别为1.73%、1.25%、1.17%、1.81%、1.44%，表明该方法重复性良好［13-15］。

2.8 加样回收率试验 精密称取本品（批号20210701）1.0 g，精密加入对照品溶液（未稀释） 适量，按“2.1.2”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 的平均加样回收率分别为100.42%，99.94%，100.54%，102.22%，98.41%，RSD分别为2.59%、1.78%、2.11%、2.81%、2.62%。

2.9 样品测定 取3 批样品，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果（mg/g，n＝3）

3 讨论

3.1 检测波长选择 采用A10 PAD 检测器，对甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 进行波长扫描，发现最大吸收波长分别为237、283、330、368、210 nm。比较不同波长下色谱图，发现杂质对所测成分的干扰较少，并且较易检出。为提高分离度，结合所测成分出峰时间，确定波长切换方式为0 ～18 min 237 nm （甘草苷），18 ～24 min 283 nm （橙皮苷），24 ～28 min 330 nm （迷迭香酸），28～35 min 368 nm （槲皮素），35～55 min 210 nm （柴胡皂苷a）［16-17］。

3.2 流动相、色谱柱选择 本实验考察了甲醇、乙腈分别与不同体积分数的磷酸、甲酸、醋酸溶液组成的流动相，发现乙腈作为有机相时基线较平稳，进一步筛选乙腈与不同浓度磷酸、甲酸、醋酸组成的流动相，发现迷迭香酸在磷酸系统下峰对称性优于甲酸、醋酸系统，因此选择乙腈-0.1%磷酸作为流动相，并分别比较Agilent C18、Waters C18、Kromasil C18色谱柱，发现3 种色谱柱均可用于含量测定［18-24］。

3.3 提取方法选择 本实验考察了回流，超声，浸渍提取方式对5 种有效成分提取率的影响，发现浸渍提取方式提取率低、耗时长，回流、超声提取对5 种成分提取率影响较小，但后者操作简便，故选用超声提取［25-27］。分别比较超声提取20、40、60 min 对5 种成分的影响，发现40、60 min 对提取率影响不大，因此选择40 min 作为提取时间。

4 结论

本实验建立HPLC 法同时测定甘草苷、橙皮苷、迷迭香酸、槲皮素、柴胡皂苷a 的含量，该方法操作简单、重复性好，可用于舒肝利胆丸的质量控制，同时也为其他医院制剂质量控制提升提供参考。