UPLC-MS/MS 法同时测定养血软坚胶囊中17 种成分的含量

刘永铭，刘树森，熊轶喆，王 翔，吴玉云，刘 瑾，潘凌云，杜国庆，詹红生∗

（1.上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心，上海 200021； 2.上海市中医药研究院骨伤科研究所，上海 201203； 3.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076； 4.上海中医药大学附属曙光医院药学部，上海 200021； 5.上海中医药大学科技实验中心，上海 201203）

养血软坚胶囊是全国名中医、著名骨伤科专家石印玉教授研制的经验方［1-2］，由白芍、秦艽、甘草、全蝎、蜈蚣、牡蛎组成，具有养血活血、软坚通络功效，临床上用于治疗骨关节炎及疼痛，可有效改善疼痛性膝骨关节炎患者临床症状，与其他相关药物相比疗效类似，但成本更低，安全性更高，有着进一步开发的价值［3-12］。

目前，养血软坚胶囊中全蝎、蜈蚣显微鉴别及钙、锌、镁含量测定已有简便快速的手段［13-14］，但该制剂质量标准仅以马钱苷酸、龙胆苦苷、芍药苷为指标成分，难以全面反映其内在质量［15］。因此，本实验参考2020 年版《中国药典》 及文献［16-21］，建立UPLC-MS/MS 法同时测定养血软坚胶囊中中芹糖甘草苷、芍药内酯苷、獐牙菜苦苷、没食子酸甲酯、苯甲酰芍药苷、獐牙菜苷、6′-Oβ-D-葡萄糖基龙胆苦苷、异甘草素、马钱苷酸、甘草素、没食子酸、芍药苷、氧化芍药苷、龙胆苦苷、甘草酸、异甘草苷、甘草苷的含量，以期保证该制剂安全性和有效性，可为其质量标准制定和后续药动学、药效学研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器 API Triple Quad 6500 三重四级杆线性离子阱质谱仪，配置电喷雾离子化源（美国AB SCIEX 公司）； Acquity 超高效液相色谱系统（美国Waters 公司）； XSE105 电子分析天平 （瑞士Mettler-Toledo 公司）； E100H 超声波清洗仪（德国Elma 公司）； 高速冷冻离心机（美国Scilogex 公司）； Milli-Q 型超纯水系统（美国Milipore 公司）。

1.2 试剂与药物 芹糖甘草苷 （ 批号J14HB188614，纯度99.7%）、芍药内酯苷（批号O31GB166251，纯度98.2%）、獐牙菜苦苷（批号M31HB181437，纯度99.8%）、没食子酸甲酯（批号AN1127SA14，纯度99.3%）、苯甲酰芍药苷（批号O10HB197203，纯度98.9%）、獐牙菜苷（批号S24HB196112，纯度99.8%）、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷 （批号 D01HB202760，纯度99.7%）、异甘草素 （批号S26GB162199，纯度98.4%）、马钱苷酸 （批号M07HB177364，纯度98.2%）、甘草素 （批号 C26A10Q87040，纯度99.4%）、没食子酸 （批号J05GB1537040，纯度99.9%）、芍药苷 （批号 M28GB143089，纯度98.1%）、氧化芍药苷（批号N26GB169459，纯度99.2%）、龙胆苦苷（批号Y29A11Q112202，纯度99.5%）、甘草酸 （批号Y02J11L113432，纯度98.5%）、异甘草苷 （批号N16GB168197，纯度98.2%）、甘草苷 （批号Z07J12X136344，纯度98.9%） 对照品均购自上海源叶生物科技有限公司。养血软坚胶囊共5 批（批号210903、220401、220402、220403、220801），由上海中医药大学附属曙光医院药剂科提供，上海雷允上药业有限公司生产。甲醇、乙腈均为色谱纯，购自西格玛奥德里奇（上海） 贸易有限公司； 甲酸、乙酸铵均为色谱纯，购自上海阿拉丁生化科技有限公司； 水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）； 流动相2 mmol/L 乙酸铵（含0.1%甲酸） （A） -乙腈（B），梯度洗脱，程序见表1； 体积流量0.3 mL/min； 柱温40 ℃； 进样量2 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），负离子扫描，多反应监测（MRM） 模式； 离子源喷雾电压－4.5 kV； 气帘气241.3 kPa； 碰撞气48.3 kPa；温度550 ℃； 雾化气413.7 kPa； 辅助气413.7 kPa，其他参数见表2。

表2 各成分质谱参数Tab.2 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 对照品溶液制备 精密称取对照品适量，甲醇溶解，置于5 mL 棕色量瓶中，制成1 mg/mL 贮备液，精密吸取适量，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得。

2.4 供试品溶液制备 精密称取本品粉末0.35 g，置于50 mL 锥形瓶中，加入25 mL 甲醇超声提取30 min，甲醇补足减失的质量，3 000 r/min 离心5 min，取上清液，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得（取续滤液约1 mL，甲醇稀释10 倍后用于进样，进样量为2 μL）。

2.5 专属性试验 精密吸取对照品、供试品溶液各10 μL，在“2.1” “2.2” 项条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液色谱图中各成分在对照品溶液色谱图相应位置处有色谱峰，两者光谱特征一致，并且各色谱峰之间无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分UPLC-MS/MS 色谱图Fig.1 UPLC-MS/MS chromatograms of various constituents

2.6 线性关系考察 精密吸取“2.3” 项下对照品溶液适量，逐级稀释，在“2.1” “2.2” 项条件下进样测定。以对照品峰面积（Y） 对其质量浓度（X） 进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.7 精密度试验 精密吸取“2.3” 项下对照品溶液2 μL，在“2.1” “2.2” 项条件下进样测定6次，测得芹糖甘草苷、芍药内酯苷、獐牙菜苦苷、没食子酸甲酯、苯甲酰芍药苷、獐牙菜苷、6′-Oβ-D-葡萄糖基龙胆苦苷、异甘草素、马钱苷酸、甘草素、没食子酸、芍药苷、氧化芍药苷、龙胆苦苷、甘草酸、异甘草苷、甘草苷峰面积RSD 分别为0.92%、1.67%、1.52%、1.68%、1.93%、1.51%、1.96%、1.67%、1.08%、1.43%、0.87%、1.95%、1.86%、1.75%、1.42%、1.82%、1.03%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取“2.4” 项下供试品溶液适量，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.1” “2.2” 项条件下进样测定，测得芹糖甘草苷、芍药内酯苷、獐牙菜苦苷、没食子酸甲酯、苯甲酰芍药苷、獐牙菜苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、异甘草素、马钱苷酸、甘草素、没食子酸、芍药苷、氧化芍药苷、龙胆苦苷、甘草酸、异甘草苷、甘草苷峰面积RSD 分别为 1.46%、3.30%、0.70%、3.16%、1.64%、2.69%、3.83%、1.91%、1.48%、2.34%、1.26%、3.40%、2.79%、1.75%、1.92%、2.07%、2.45%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.9 重复性试验 取同一份本品，按“2.4” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.1” “2.2”项条件下进样测定，测得芹糖甘草苷、芍药内酯苷、獐牙菜苦苷、没食子酸甲酯、苯甲酰芍药苷、獐牙菜苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、异甘草素、马钱苷酸、甘草素、没食子酸、芍药苷、氧化芍药苷、龙胆苦苷、甘草酸、异甘草苷、甘草苷峰面积RSD 分别为1.08%、2.50%、2.64%、1.18%、2.32%、2.18%、1.95%、2.29%、2.00%、2.38%、2.35%、1.73%、1.50%、2.88%、2.44%、1.73%、1.52%，表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 取各成分含量已知的本品（批号220801） 6 份，每份约0.175 g，精密称定，加入“2.3” 项下对照品溶液适量，按“2.4” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” “2.2” 项条件下进样测定，计算回收率。结果，芹糖甘草苷、芍药内酯苷、獐牙菜苦苷、没食子酸甲酯、苯甲酰芍药苷、獐牙菜苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、异甘草素、马钱苷酸、甘草素、没食子酸、芍药苷、氧化芍药苷、龙胆苦苷、甘草酸、异甘草苷、甘草苷平均加样回收率分别为100.43%、93.79%、93.90%、98.03%、92.87%、103.59%、98.45%、103.39%、97.64%、103.32%、101.38%、91.33%、94.81%、99.44%、104.03%、95.85%、93.76%，RSD分别为2.43%%、3.50%、2.65%、1.91%、2.82%、2.21%、3.06%、2.69%、1.58%、1.92%、1.66%、2.38%、3.40%、2.47%、2.51%、1.68%、2.41%。

2.11 样品含量测定 取5 批样品，按“2.4” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1” “2.2” 项条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果（mg/g，n＝5）Tab.4 Results for content determination of various constituents （mg/g，n＝5）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 养血软坚复方在临床上存在胶囊、片剂2 种剂型，但后者工艺研究尚未成熟，使用过程中逐渐被淘汰，目前大多应用前者［22］。本实验首先比较了不同提取溶剂（50%甲醇、70%甲醇、甲醇），发现甲醇提取时各成分含量最高，再比较了不同提取时间（15、30、45 min），发现与提取15 min 时相比，提取30 min 时各成分含量更高，并且提取30、45 min 时无明显差异，最终确定甲醇超声提取30 min 作为供试品溶液制备方法。

3.2 流动相选择 本实验分别考察了水-甲醇、水-乙腈、0.1% 甲酸-乙腈、2 mmol/L 乙酸铵（含0.1% 甲酸） -乙腈，发现2 mmol/L 乙酸铵（含0.1%甲酸） -乙腈能显著提高各成分色谱峰与杂质峰之间的分离度，并且峰形更优，最终确定其作为流动相。

4 结论

本实验建立UPLC-MS/MS 法同时测定养血软坚胶囊中芹糖甘草苷、芍药内酯苷、獐牙菜苦苷、没食子酸甲酯、苯甲酰芍药苷、獐牙菜苷、6′-Oβ-D-葡萄糖基龙胆苦苷、异甘草素、马钱苷酸、甘草素、没食子酸、芍药苷、氧化芍药苷、龙胆苦苷、甘草酸、异甘草苷、甘草苷的含量，该方法简便准确，可为该制剂全面科学的质量评价提供参考。