姜黄素抑制巨大肩袖撕裂中肌肉脂肪浸润的机制研究

杨耿华 叶沃权 何树荣 何伟平

肩袖撕裂作为临床中较为常见的一种疾病，该疾病主要表现为会引起患者的肩关节出现疼痛、乏力和功能障碍等临床症状的发生[1]。肩袖撕裂疾病在发病的早期可以优先采取保守治疗方式，若保守治疗无效后再采取关节镜下肩袖修补手术治疗。针对肩袖撕裂情况不严重的患者，早期的关节镜下肩袖修补手术治疗就能够取得较为显著的治疗效果[2]。但是该治疗方式对于肩袖撕裂严重的情况，修补手术并不能满足患者的病情需求且效果较差。我国中医骨伤科将肩袖撕裂归属于“慢性筋骨病”范畴，针对该疾病“气虚血瘀，本虚标实”的特征，基于中医外科内治法-托法治疗原则，运用适合的中医疗法进行正确的干预和预防，对该疾病的治疗取得了较好的治疗效果[3-4]。基于此，本研究主要是分析在巨大肩袖撕裂中肌肉脂肪浸润的治疗中，在托法原则的基础上姜黄素靶向内核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含热蛋白结构域蛋白3（nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat protein 3，NLRP3）/ 炎症小体炎症因子白细胞介素1β（recombinant human interleukin-1β，IL-1β）炎性通路的抑制作用及机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

本次研究主要分为2 个研究阶段，即第一阶段（2021年7月—2022年7月）和第二阶段（2022年8月—2023年7月），其中第一阶段期间首先通过对姜黄素复合物进行制备，并做好相应的准备工作，再开启第二阶段研究计划；第二阶段通过构建30 只大鼠肩关节慢性巨大肩袖撕裂模型，模型大鼠为无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级健康雄性SD 大鼠，体质量250 ～300 g。研究采用的30只大鼠均在研究前于温度为20℃～22℃恒温动物房中进行饲养，温度控制在（60±10）%，每间隔12 h 进行1 次光照与黑夜交替，大鼠正常自主进食和饮水，于研究前均进行造模前适应性饲养7 d 。构建30 只大鼠肩关节慢性巨大肩袖撕裂模型，并根据姜黄素给入的剂量不同将30 只大鼠模型分为3组，即普通膳食组、姜黄素混合膳食低剂量组、姜黄素混合膳食高剂量组，每组各有大鼠模型10 只。其中，普通膳食组中雄雌各5 只，雄（2.01±0.12）月龄，雌（2.50±0.09）月龄；体质量约为：雄（360.57±59.84）g，雌（250.12±137.59）g；姜黄素混合膳食低剂量组中雄性大鼠有6 只、雌性大鼠有4 只，雄（2.12±0.11）月龄，雌（2.38±0.10）月龄；体质量约为：雄（361.20±58.26）g，雌（250.74±138.03）g；姜黄素混合膳食高剂量组中雄性大鼠有7 只、雌性大鼠有3 只，雄（2.11±0.12）月龄，雌（2.40±0.10）月龄；体质量约为：雄（362.19±58.34）g，雌（251.07±139.01）g。3组大鼠模型的雄雌性别、月龄以及体质量对比差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 试剂配制 利用800 mg 透明质酸（hyaluronic acid，HA）（1 000 ～1 500 kDa）溶于1：1 V/V（H2O/DMSO）混合物80 g，加入100 mg 二环己基碳二亚胺（dicyclohexylcarbodiimide，DCC）和二甲氨基（4-dimethylaminopyridine，DMAP）；搅拌1 h将溶液与75 mg 姜黄素溶解；在65°C 下放置约6 h；溶液用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）透析1 d，然后去离子水透析放置3 d；制成的HA-姜黄素复合物脱水后在4℃保存。姜黄素复合物溶于磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer salt solution，PBS）后除菌过滤可直接作用于细胞。

1.2.2 造模与给药 （1）大鼠称重麻醉后镇痛，肩关节备皮消毒铺巾，暴露冈上肌、冈下肌穿线标记，直视切断后冲洗伤口，逐层关闭伤口；术后予青霉素预防感染，并予以镇痛；术后3 d 大鼠完全恢复后开始进行3组膳食喂养；普通膳食组大鼠采取正常饲养、姜黄素混合膳食低剂量组在正常饲养的基础上每天注射，姜黄素100 mg/（kg·d）；姜黄素混合膳食高剂量组在正常饲养的基础上每天注射姜黄素500 mg/（kg·d）；每2 天对大鼠的大体状态进行观察，并记录其体质量的变化情况。（2）3组大鼠分别进行喂养3个阶段，即第2、3、4 周，每个喂养周期抽取部分大鼠模型进行安乐死，从而获取大鼠肩关节处组织，制备成相应的肩关节标本，比较3组大鼠模型的脂肪浸软程度[5-6]。

1.2.3 炎症因子指标检测 通过对3组大鼠模型的炎症因子采取酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）方法进行检测，对于检测的炎症因子含量根据试剂盒说明书的要求进行测定。ELISA 检测NLRP3/IL-1β 分泌：取培养后上清加100 μL/孔检测试剂到96孔酶标板，4℃放置过夜；第2 天弃去上清，苯二甲酸丁二醇酯（butanediol ester of phthalate，PBST）洗涤3 次，每孔加入150 μL 1%生血清白蛋白（body surface area，BSA）37℃封闭1 h；PBST 洗涤3 次，每孔加入100 μL 不同倍比稀释度的上清，并加入对照样品，37℃孵育2 h；PBST 洗涤5次后，加入100μL稀释后的辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗，37℃孵育1 h；PBST 洗涤5 次后，显色剂显色20 min，酶标仪上读取A405 吸光度[7-8]。

1.3 观察指标

通过对30 只大鼠肩关节慢性巨大肩袖撕裂模型分别进行药物干预后，获取3组大鼠模型在第2、3、4 周的肩关节固定脱钙组织切片，分别检测3组大鼠模型的脂肪浸软程度，从而对3组大鼠模型的肌脂肪浸润进行有效评估；并对大鼠巨大肩袖撕裂肌肉组织中NLRP3、IL-1β 指标进行检测，探讨姜黄素对巨大肩袖撕裂中肌肉脂肪浸润的抑制作用。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 3组大鼠模型脂肪浸润的评估

3组大鼠模型在正常情况下对比发现，姜黄素混合膳食高剂量组在第2 周以及第4 周的脂肪浸润情况明显优于普通膳食组和姜黄素混合膳食低剂量组（见表1），但经过秩和检验统计显示，3组数据结果Z=0.242，3组数据结果差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 3组大鼠模型脂肪浸润（正常情况）的评估 [只（%）]

相比于普通膳食组而言，姜黄素混合膳食低剂量组和姜黄素混合膳食高剂量组的脂肪浸润得到明显的改善；姜黄素混合膳食低剂量组和姜黄素混合膳食高剂量组的脂肪浸润评估类型中部分撕裂对脂肪浸润明显的降低，大鼠模型脂肪逐渐趋于正常，但普通膳食组的脂肪浸润的部分撕裂显示脂肪浸润更严重（见表2）。经过秩和检验统计显示，Z=2.879，3组数据对比差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 3组大鼠模型脂肪浸润（部分撕裂情况）的评估 [只（%）]

相比于普通膳食组而言，姜黄素混合膳食低剂量组和姜黄素混合膳食高剂量组的脂肪浸润得到明显的改善；姜黄素混合膳食低剂量组和姜黄素混合膳食高剂量组的脂肪浸润评估类型中完全撕裂对脂肪浸润明显的降低，大鼠模型脂肪逐渐趋于正常，但普通膳食组的脂肪浸润的完全撕裂显示脂肪浸润更严重（见表3）。经过秩和检验统计显示，Z=2.961，3组数据对比差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 3组大鼠模型脂肪浸润（完全撕裂情况）的评估 [只（%）]

表4 3组大鼠模型炎症因子的检测（pg/mL， ±s）

表4 3组大鼠模型炎症因子的检测（pg/mL， ±s）

注：与普通膳食组对比，P①＜0.05，P②＜0.05；与姜黄素混合膳食低剂量组相比，P①＜0.05，P②＜0.05。

组别NLRP3IL-1β普通膳食组（n=10）6.85±0.3644.33±2.83姜黄素混合膳食低剂量组（n=10）5.10±0.24①35.64±1.53①姜黄素混合膳食高剂量组（n=10）4.02±0.11②31.26 ±1.19②F 值12.7907.145 P 值0.0000.000

2.2 3组大鼠模型炎症因子的检测

相比于普通膳食组大鼠模型而言，姜黄素混合膳食低剂量组和姜黄素混合膳食高剂量组的炎症因子水平均明显下降，且姜黄素混合膳食高剂量组下降的具有明显的特征性；两两进行比较发现，普通膳食组与姜黄素混合膳食低剂量组和姜黄素混合膳食高剂量组的炎症因子对比差异有统计学意义（P＜0.05）；姜黄素混合膳食低剂量组与姜黄素混合膳食高剂量组的炎症因子对比差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

作为我国中医骨伤科疾病中较为常见的一种疾病，肩袖撕裂在中医中主要属于慢性筋骨疾病的一种，且针对该疾病若在临床中不予以及时有效地治疗，将会诱发患者的肩袖撕裂发展为巨大肩袖撕裂，最终形成关节炎，这对患者的日常生活和生活质量水平都会造成严重的影响[9]。我国中医对于慢性肌腱疾病的治疗具有较为广泛的研究，常以“气血兼顾、筋骨并重”作为主要的治疗指导方式，并将中医外科内治法-托法治疗原则也运用其中，通过该托法治疗原则帮助肩袖撕裂疾病患者补益气血或透脓扶助正气、托毒外出[10]。针对慢性巨大肩袖撕裂疾病，主要的表现为撕裂部位炎症持续、脂肪浸润，遂于此，该疾病特点也正好是托法治疗的最佳适应证。

炎性小体作为细胞质复合物，该复合物会对微生物感染以及细胞损伤情况产生相应的免疫反应，这也就使得炎性小体具有受体识别的能力，因此目前该复合物也是作为炎性反应的识别器。本次研究的NLRP3 是NLR 蛋白家族的一种，该炎性小体中NLRP3 经常参与到人体疾病的全过程，因此临床上对于NLRP3 的研究也较为广泛。目前，对于NLRP3炎性小体而言，该炎性小体的激活性受众面较广，不仅局限于细菌毒素和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP），还包括一系列的广泛刺激物，如微生物等。当NLRP3 炎性小体被刺激性激活后，该炎性小体会产生半胱氨酸蛋白酶-1（cysteine aspastic acid-specific protease 1，Caspase-1）， 该物质能够将IL-1β 从无活性转变为成熟性，同时对于炎症因子也具有较好的促进性。而成熟后的IL-1β 作为促炎介质，在需要免疫活动中具有十分显著的作用性。此外，炎症小体也能够被二氧化硅（silicon dioxide，SiO2）刺激激活，同时能够形成IL-1β 等炎症因子，从而引发一系列的免疫反应。

姜黄作为托法治疗中最为常见的一种中草药，该药物不仅具有较好的抗炎效果，能够对免疫活性进行有效的调节，还能够促进患者的组织重新进行生长。有研究显示[11]，NLRP3 炎性小体活化下的IL-1β 等炎症因子下的检测显示，姜黄素可以在剂量方面依赖性地抑制细胞因子IL-1β成熟，并在成熟后进行分泌。此外，姜黄素作为姜黄的提取物，其也具有抗炎、抗氧化的作用性；这也就使得该药物能够有效地阻断NLRP3 炎性小体的活化，从而能够有效地抑制Caspase-1 的剪切活化，从而达到对IL-1β 等炎症因子的下调作用。本次研究显示，姜黄素混合膳食低剂量组和姜黄素混合膳食高剂量组的炎症因子水平均明显下降，且姜黄素混合膳食高剂量组下降的具有明显的特征性。说明姜黄素能够有效地降低肩袖撕裂炎症情况，改善肩袖撕裂区域的微循环状况。而NLRP3 炎症小体能够有效地识别多重诱导炎症的刺激并激活IL-1β 的成熟及其他一些重要促炎因子的产生和释放，最终使细胞能够发生炎症反应，同时，姜黄素能够减少骨骼肌炎性的损伤，降低炎性因子的水平，从而有效地抑制NLRP3/IL-1β 炎性通路与NLRP3 炎性体轴的激活，这也进一步地提示姜黄素在针对大鼠肩袖撕裂的治疗上具有较好的预防和干预效果[12]。

综上所述，根据托法理论的治疗原则，利用姜黄素治疗巨大肩袖撕裂能够有效地干预该疾病的脂肪浸润，这主要是由于姜黄素治疗能够通过对NLRP3 炎症小体进行有效的抑制，减少IL-1β 的生成，能够通过NLRP3/IL-1β炎性通路抑制骨骼肌干细胞的脂肪分化，减少慢性过程中肌肉的脂肪浸润，从而改善肩袖肌腱肌肉的生物活力，因此，该治疗方式为临床肩袖撕裂保护治疗提供新的选择思路，为托法理论在肩袖疾病上创新运用提供充分的基础证据，具有较好的应用前景和较大的社会价值。