2021—2022年我国部分地区猪轮状病毒分子流行病学调查

何晓明，田小艳，王东东，刘桂武，李春梅，叶敏慧

(温氏食品集团股份有限公司，广东 云浮 527400)

轮状病毒(rotavirus，RV)隶属呼肠孤病毒科，是各种幼龄动物非细菌性腹泻的主要病原之一[1]。在我国，猪轮状病毒(porcine rotavirus，PoRV)感染非常普遍，PoRV感染后，使仔猪机体免疫力急剧下降，从而诱发多种腹泻病原混合感染，导致仔猪死亡率上升或生长缓慢、停滞[2]。猪轮状病毒的基因组是由11个独立片段的双股正链RNA(dsRNA)组成。分别编码6种结构蛋白(VP1～VP4，VP6和VP7)和6种非结构蛋白(NSP1～NSP6)，其中，第11节段有的编码2种蛋白(NSP5和NSP6)[3]。PoRV的11个基因之间均易发生重配事件[4]。病毒粒子有3层衣壳，呈20面体对称，最外层为VP7和VP4，VP7和VP4的特异性可将轮状病毒分为2个血清型，分别是G型(VP7)和P型(VP4)[5]，且G型与P型之间会产生不同的组合，不同组合型的PoRV毒株诱导的交叉保护性低[6]。根据2013年分类方法，以及外衣壳蛋白VP4、VP7和VP6基因序列，将轮状病毒分为G、P和I基因型[7]。轮状病毒基因群、基因型多样，且不同国家和地区流行类别不同。目前，在人和动物PoRV中已鉴定出35种G基因型、50种P基因型[8]和18种I基因型。

本研究拟对2021—2022年采自广东、广西、江西、湖南、云南和贵州6个省份的规模化猪场腹泻样品进行PoRV检测，对阳性场样品进行VP4和VP7基因测序，采用生物信息学软件进行氨基酸序列分析和系统进化分析，了解猪群PoRV的感染情况和流行趋势，丰富PoRV分子流行病学资料，为有效防控PoRV提供科学依据，为新型疫苗研发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料样品

2021—2022年来自广东、广西、江西、湖南、云南和贵州6省规模化猪场送检的腹泻样品，共计86个猪场，6 472份样品。按1∶1体积比加入无菌PBS并震荡混匀，反复冻融3次，4 ℃ 5 000 r/min离心5 min，取上清液置于-20 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

核酸提取试剂盒购自杭州博日科技股份有限公司，HiScript®Ⅱ One Step RT-PCR Kit、DL2000 plus DNA Marker购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。

1.3 引物设计

用于检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)，猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)，PoRV，猪德尔塔冠状病毒(porcine deltcoronavirus，PDCoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)的引物均参照文献[9-10]合成。同时，根据GenBank上登录的PoRV VP7和VP4基因序列分别设计VP7、VP4基因特异性扩增引物。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息见表1。

表1 引物信息

1.4 临床样品RT-PCR检测

吸取备用检测样品300 μL，使用博日抽提试剂盒及配套核酸提取仪，按操作说明书进行操作，提取的核酸于-20 ℃保存。使用HiScript®Ⅱ One Step RT-PCR Kit进行配置反应体系，2×PCR Master Mix 12.5 μL，One Step Enzyme Mix 1.25 mL，20 μmol/L上下游引物各0.5 μL，RNA 5 μL，RNase-free ddH2O 5.25 μL，混合均匀。PCR反应条件为：50 ℃ 30 min，94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物经1.2%琼脂凝胶电泳，判定结果。

1.5 PoRV VP7和VP4基因扩增、测序

对PoRV阳性感染猪场的RT-PCR检测条带较亮样品的核酸进行VP7、VP4基因的扩增，反应体系为：2×PCR Master Mix 12.5 μL，One Step Enzyme Mix 1.25 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板5 μL，ddH2O 5.25 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1.2 min，30个循环；72 ℃延伸 10 min。反应结束后，取5 μL PCR产物经1.2%琼脂凝胶电泳，将阳性扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.6 PoRV VP7和VP4基因型鉴定及序列分析

将测序获得的VP7和VP4基因的核苷酸序列在NCBI BLAST在线分析，精准确定相应毒株的基因型，采用Lasergene软件、MEGA11.0等软件进行分析。本研究中所使用的82个参考序列 (表2)均从 GenBank 获得。

表2 参考序列

2 结果

2.1 腹泻样本PoRV的检测

2021—2022年间，共检测了86个种猪场的6 472份腹泻样品，所有样品均未检测到TGEV和SADS-CoV病原。PEDV、PoRV和PDCoV猪场阳性率分别为：11.63%(10/86)、65.12%(56/86)和4.65%(4/86)，样品阳性率分别为：11.80%(764/6 472)、27.89%(1 805/6 472)和2.92%(189/6 472)，提示PoRV可能是引起这些猪场腹泻的主要病因。此外，几种腹泻病毒还呈现不同程度的混合感染，如PoRV和PEDV的混合感染率为4.57%(296/6 472)，PoRV和PDCoV的混合感染率为0.32%(21/6 472)。

2.2 PoRV VP7基因分型及系统进化分析

将本研究中测序获得的76株PoRV VP7基因序列与GenBank中已知G基因型的代表毒株通过MEGA11.0软件进行遗传进化分析，结果显示(图1)：共检测到8种基因型，其中G9为优势基因型(42.10%)，G5、G26、G3、G4、G1、G2和G11 各占26.32%、9.21%、6.58%、6.58%、3.95%、2.63%和2.63%。云南省猪场检测到除G4型以外的7种基因型，YNLSTC猪场在2年内监测到3种G型，分别为G1、G3和G5；其余监测猪场暂未检测到不同的G基因型；广东省猪场检测到的毒株以G9(11/21)和G5(8/21)为主；江西省猪场检测到的毒株以G9(9/15)为主；广西省猪场检测到的毒株以G9(4/15)为主；湖南省猪场检测到G9(5/7)和G26(2/7)两种基因型。由于轮状病毒各G型毒株之间氨基酸的同源性较低，仅对测序获得的32株G9优势基因型和9株参考G9基因型的氨基酸进行同源性分析，VP7基因之间氨基酸同源性为72.1%～100%(图2)。测序所获得的32株P[13]基因与GenBank上美国参考毒株RVA-Pig-wt-USA-Indiana119-1-2014-G9同源性仅为72.1%～74.9%。从氨基酸同源性结果来看，监测的猪场目前暂未发现感染美国流行的G9基因型毒株。江西的JXJGC20210102、JXJGC20221027和广东的GDHSYEC20221011、GDCWC20221010共4个毒株同其他G9毒株的同源性最高只有89.9%。

△为本研究中的毒株，▲为NCBI中代表毒株；GZ为贵州省毒株，YN为云南省毒株，JX为江西省毒株，HN为湖南省毒株，GX为广西省毒株，GD为广东省毒株。下同。

图2 G9型毒株VP7基因氨基酸同源性性比较

2.3 PoRV VP4基因分型及系统进化分析

将本研究中测序获得的35株PoRV VP4基因序列与NCBI中已知P基因型的代表毒株通过MEGA11.0软件进行遗传进化分析(图3)，结果显示：共检测到5种P基因型，以P[13]型为主，占57.14%，其次为P[7]、P[23]、P[3]和P[6]型，占比分别为20%、14.29%、5.71%和2.86%。广东省猪场检测到 P[6]、P[7]、P[13]和P[23]共4种基因型，云南省和江西省猪场检测到P[7]和P[13]2种基因型毒株，广西省猪场检测到P[13]和P[23]2种基因型毒株，湖南省猪场检测到P[3]和P[13]2种基因型毒株，贵州省检测到P[7]和P[23]2种基因型毒株。由于轮状病毒各P型毒株之间的同源性较低，仅对20株P[13]优势基因型和5株参考P[13]基因型的氨基酸进行氨基酸同源性分析，VP4基因之间氨基酸同源性为72.5%～100%(图4)，测序所获得的20株P[13]基因与GenBank上的P[13]型参考毒株RVA-Murine-tc-CHN-SCLS-M-2018同源性在89.3%～97.2%之间，与参考毒株RVA-Pig-wt-BRA-SUI26A-2008同源性在72.5%～76.5%之间，从氨基酸同源性结果来看，猪场P[13]基因型毒株与鼠源轮状病毒较高，推测可能是鼠源轮状病毒通过老鼠感染了猪群。

图3 基于PoRV VP4序列(810 bp)利用邻近法构建的遗传进化树

图4 P[13]型毒株VP4基因氨基酸同源性比较

2.4 PoRV G/P基因型分型

35份样本成功鉴定出G/P组合基因型，共包括15种G/P基因型组合，G9P[13](28.57%)为优势组合基因型，其他基因型为G5P[13](11.43%)、G4P[13](8.57%)、G9P[23](8.57%)、 G26P[13](5.71%)、G1P[7](5.71%)、G26P[3](5.71%)、G5P[7](5.71%)、G3P[7](2.86%)、G11P[23](2.86%)、G5P[23](2.86%)、G11P[7](2.86%)、G3P[13](2.86%)、G5P[6](2.86%)和G4P[7](2.86%)，其中G11P[7]为国内首次鉴定的基因型组合，PoRV的基因型详细分布见表3。

表3 猪场PoRV感染基因型的分布

3 讨论

本研究通过对2021—2022年贵州、云南、江西、湖南、广西和广东6个省共86个规模化猪场的6 472份仔猪腹泻粪便样本进行了腹泻相关病毒检测，PoRV、PEDV和PDCoV阳性率分别为27.89%、11.80%和2.92%，猪场阳性率分别为65.12%、11.63%和4.65%；PoRV和PEDV的混合感染率为4.57%，PoRV和PDCoV的混合感染率为0.32%。本研究结果表明PoRV在不用地区猪场中感染严重且分布广泛，有必要继续加强对不同猪场PoRV的监测，为PoRV感染的防控提供了重要的科学依据。

VP7和VP4分别决定轮状病毒的G型和P型，且G型与P型之间会产生不同的组合，不同组合型的轮状病毒毒株诱导的交叉保护性低[3，5]。目前PoRV在全球范围内广泛流行，基因型多样，加强对PoRV不同G/P基因型的监测和研究，对了解PoRV的遗传进化和疫苗研究非常重要。在本研究中，G9和G5为流行G基因型，分别占分型毒株的42.11%和26.32%；P[13]、P[7]和P[23]为流行P基因型，分别占分型毒株的57.14%、20%和14.29%，其中P[13]型PoRV最具多样性和复杂性；优势G/P组合基因型为G9P[13]，占分型样本的28.57%。其中广东和云南的组合基因型最为复杂，存在6种不同的基因型组合，推测原因可能是广东和云南猪场PoRV感染率升高的同时，PoRV流行基因型之间重组频率也在逐渐增高，后期应加强对广东、云南地区猪群PoRV分子流行病学的监测，重视对猪群轮状病毒的防控与管理。本研究还在云南地区检测出了G11P[7]，该组合基因型首次在国内出现。周群等[11]对2017—2019年四川省猪A群轮状病毒分子流行病学进行调查，揭示G9型和P[13]型为分别为优势G基因型和P基因型，G9P[23]为优势组合基因型。本研究结果也表明G9和P[13]型为主要的基因型，与周群等[11]的监测结果一致，但优势组合基因型为G9P[13]，与2017—2019年四川地区优势基因型不同。

猪轮状病毒流行率不断增加，遗传多样性越来越复杂。因此，分子流行病学方面的研究应该不断更新，有助于更好地了解PoRV的流行病学特征，对PoRV感染的防控具有重大指导意义，也为新型疫苗候选株的筛选提供了参考。