基于矿物元素指纹图谱对新疆皮山红羊真实性鉴别

赵莱昱，张鸿儒，王 晶 ，张春晖

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；2.新疆畜牧科学院，新疆 乌鲁木齐 830000）

中国是羊养殖大国，具有巨大的羊肉生产能力和消费潜力，截至2022年，中国羊肉产量约达到全球产量的30%[1]。新疆独特的地理位置和优良的自然环境使得该地区畜牧业成为中国畜牧发展的主要支柱，特色绵羊品种也因此孕育而生[2]。新疆皮山红羊体型高大、肉脂厚、屠宰率高，是我国多胎绵羊遗传资源的一个新种群，因其较强的繁殖和抗病能力受到广泛关注，被认为是新疆皮山的地理标志性产品之一。皮山红羊在国内竞争激烈的羊肉市场中获得高度重视的同时，其涉及的食品真实性及来源问题也不容忽视。因此，对标识新疆皮山红羊进行品种真实性鉴别，也是保护新疆特色绵羊资源的重要手段之一。

矿物质指纹图谱分析被认为是一种有效的、可用于食品及农产品鉴定的分析技术[3-5]。由于生物自身无法进行矿物元素的合成，必须从水、土壤、空气等周边环境中获得，因此，在不同地域和不同的生物体内都会存在各自独特的矿物元素指纹特征，可利用矿物元素指纹图谱技术鉴定食品真实性[6]。电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICPMS）作为一种灵敏度高、检测速度快的检测技术，已被广泛应用于不同动物制品的矿物质鉴别分析[7-8]，且由于动物制品的品种、研究地域等差异，筛选出的矿物元素鉴别指标也大不相同。例如，Andersson等[9]通过将矿物元素与多元统计分析相结合，发现Cs能够用于鉴别高海拔区域的绵羊品种；刘美玲[10]通过研究发现，Cd、Sb、Se和Cs元素能够区分来自内蒙古不同区域的绵羊肉，且微量元素含量与其瘦肉比例呈显著正相关；马梦斌等[11]筛选出以Ca、P、Cr、Mn、Ni、Cu、Se、Rb、Mo和Sn为指标的判别模型，用于判别来自不同地区的滩羊肉，其模型准确率高达100%。因此，利用矿物质元素确定皮山红羊特定的矿物指纹特征，可为新疆皮山红羊的真实性鉴别提供可靠手段。

本研究以新疆地区皮山红羊为实验对象，以中国常见的湖羊品种为对照，在相同的环境和条件下进行饲养及实验。动物背最长肌及半腱肌肌纤维类型不同，是科学研究和家庭烹饪中最常使用的两种肌肉部位[12]，因此本研究利用ICP-MS技术，测定2 个羊肉品种背最长肌及半腱肌的51 种矿物元素组成与含量，结合多元统计分析构建皮山红羊鉴别和验证模型，筛选具有代表性的鉴别指标，以期为新疆皮山红羊矿物元素指纹图谱的建立提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2022年1月，本研究选用6 月龄、平均体质量为50～55 kg、健康状况良好的雄性新疆皮山红羊和湖羊各36 只作为实验材料，均由新疆西域沐羊人农牧科技有限公司提供。将两个品种羊进行屠宰后，分别取其背最长肌及半腱肌（200.00±10.00）g，装袋标记，于－20 ℃真空密封条件下运输到实验室后，在冷冻状态下剔除筋膜及可见脂肪，于－80 ℃冷冻真空保存。

过氧化氢溶液、浓硝酸（均为分析纯）国药集团化学试剂有限公司；超纯水（＞18.20 MΩ·cm)江苏默乐生物科技股份有限公司；环境校正样品（Part number 5183-4688）、元素校正样品（Part number 8500-6944）、标准品72Ge、115In、209Bi 美国Agilent Technologies公司。

1.2 仪器与设备

Mars Lp5微波消解仪 美国CEM公司；7700X ICP-MS仪 美国Agilent Technologies公司；电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；FD-1A-50真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

皮山红羊、湖羊（背最长肌、半腱肌）：分别称取约50 g肌肉样品，并制备成1 cm3方块，冷冻干燥1 周后取出研磨至粉碎，并记录冻干前后质量。将粉碎后的肌肉样品过100 目筛，利用索式抽提法去除其中粗脂肪，收集剩余残渣，待测。

1.3.2 微波消解

参考孙淑敏等[13]方法，称取150 mg冻干羊肉样品于消解管中，加入8 mL硝酸溶液（体积分数为65.00%）预消解1 h，再加入2 mL过氧化氢溶液（体积分数为30.00%），将其放入微波消解仪中，采用程序升温法进行消解。具体消解升温程序：以8 ℃/min速率由0 ℃升温至120 ℃，维持2 min；随后以8 ℃/min速率升温至160 ℃，维持5 min；以4 ℃/min速率升温至180 ℃，维持15 min。将消解液冷却至室温，超纯水将其定容到100 mL。

1.3.3 ICP-MS工作条件

射频功率1280 W；喷淋温度2 ℃；采样深度8 mm；冷却剂气体流量1.47 L/min；载气流速1 L/min；补充气体流量1 L/min。

1.3.4 元素定量分析

参考孙淑敏等[13]的方法，利用微波消解结合ICP-MS外标法对羊肉中矿物元素进行定量（以干质量计），以冻干前后质量为依据，计算鲜肉中矿物元素的含量（以鲜质量计）。以环境校正标样和元素校正标样为标准样品，得到的标准曲线决定系数在0.99以上；仪器稳定性利用内标元素72Ge、115In和209Bi的相对标准偏差进行检验。

1.4 数据处理

采用SPSS 23.0软件对新疆皮山红羊及湖羊肌肉样品中的矿物元素含量进行单因素方差分析与Tukey多重比较分析，显著性差异为P＜0.05，结果用表示。采用RCore Team（2016）软件对矿物元素含量进行线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）、K-折交叉验证及偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）。

2 结果与分析

2.1 新疆皮山红羊矿物质元素组成差异分析

如表1所示，对新疆皮山红羊和湖羊背最长肌及半腱肌中51 种矿物元素含量进行单因素方差分析及Tukey事后检验，确定了28 种矿物元素含量存在显著差异（P＜0.05），包括5 种常量元素（Na、P、K、43Ca、44Ca）、8 种微量元素（Al、Mn、Fe、Zn、Se、Sr、Sn、Tb）、13 种稀有元素（Co、Mo、Rh、Pd、Te、Cs、Ba、La、Nd、Dy、Ho、Tm和Hf）和2 种有害金属元素（Cr、Sb）。

表1 皮山红羊、湖羊背最长肌及半腱肌中矿物元素含量（n＝36）Table 1 Contents of mineral elements in semitendinosus and longissimus dorsi muscles of Pishan Hong sheep and Hu sheep (n =36)

常量元素在动物肌肉中含量较高，其含量由高到低依次为K、P、Na、Mg、Ca，而K作为重要的常量元素，在皮山红羊的背最长肌中含量最高。除Mg元素外，其他常量元素均在不同羊肉品种及不同肌肉间存在显著差异（P＜0.05），且品种间差异在背最长肌中表现得更为显著，皮山红羊背最长肌的常量元素含量显著高于湖羊。大多数微量元素含量也在不同品种及肌肉部位间存在显著差异（P＜0.05）。Fe和Zn是最重要的2 种微量元素，与湖羊相比，这2 种元素在皮山红羊肌肉中检测到较高含量，表明皮山红羊肌肉是这两类矿物元素良好的食物来源。此外，皮山红羊肌肉中还检测到较高含量的Mn和Sn元素，且在背最长肌中的含量最高。

稀有元素在动物体内含量极低，共有13 种稀有元素在不同羊肉肌肉中的含量显著差异。其中，Co、Mo、Pd、Cs、Ba、La和Hf元素在不同肌肉样品中检测到，红羊背最长肌中Mo、Pd和Hf元素含量最高，而Ba和Co元素以及Cs和La元素也分别在湖羊的背最长肌和半腱肌中呈现出最高含量。除以上7 种稀有元素外，Rh、Te、Dy、Ho和Tm元素仅在皮山红羊肌肉中检测到，这些元素可以作为鉴定皮山红羊的重要稀有元素；而Nd元素未在湖羊的半腱肌中检出。除以上元素外，共检出6 种有害金属，仅Cr和Sb元素具有显著差异（P＜0.05），且这两种元素在皮山红羊中含量较高。

另一方面，对比不同肌肉部位间矿物元素差异发现，矿物元素Na、K、43Ca、44Ca、Mn、Zn、Se、Sr、Mo、Pd、Ba、Ho、Hf、Cr、Sb、Nd、La、Te和Rh在皮山红羊背最长肌中的含量显著高于半腱肌（P＜0.05），说明矿物元素在红羊背最长肌中更容易沉积。相比之下，只有9 种矿物元素（Na、43Ca、44Ca、Al、Sr、Ba、Nd、Ho和Cr）在湖羊的背最长肌中含量显著高于半腱肌（P＜0.05），而Sn、La和Cs元素则在湖羊半腱肌中含量较高，表明皮山红羊不同肌肉部位间矿物元素差异更大。

2.2 LDA

基于不同羊肉品种及肌肉部位间元素差异分析可以看出，利用矿物元素对皮山红羊品种真实性鉴别具有一定的可行性。为进一步明确矿物元素指标对皮山红羊的判别作用及效果，利用存在显著差异的28 种特征元素（Na、P、K、43Ca、44Ca、Al、Mn、Fe、Zn、Se、Sr、Sn、Tb、Co、Mo、Rh、Pd、Te、Cs、Ba、La、Nd、Dy、Ho、Tm、Hf、Cr和Sb）进行LDA。LDA是一种有监督的数据分类方式，可利用各类样品之间的相关性建立判别模型而对未知样品进行分类，并利用交叉验证检验判别模型的稳定性，得到的判别模型结果如图1所示。

图1 基于差异矿物元素的LDAFig.1 LDA plots based on differential mineral elements

由图1a可以看出，前两个判别函数分别解释了总判别函数的65.03%和19.42%，合计解释了84.45%，表明判别模型结果有代表性，羊肉不同品种及不同肌肉基于差异矿物元素有明显的区分效果。皮山红羊背最长肌位于判别函数1左侧及判别函数2上侧，其半腱肌则位于判别函数1右侧及判别函数2下侧，而湖羊的背最长肌则更多集中在判别函数1的右侧及判别函数2上侧，说明皮山红羊的两个肌肉部位都与湖羊有明显区分，表明矿物元素对皮山红羊的鉴别效果在不同肌肉间都十分显著，基于特征矿物指纹特征对皮山红羊进行真实性鉴别的效果良好。同时，为了进一步区分不同种类矿物元素对皮山红羊的判别效果，基于存在显著差异的常量元素以及其他元素分别建立线性判别模型，结果如图1b、c所示。常量元素对皮山红羊的鉴别效果并不明显，而微量元素和稀有元素的鉴别效果则十分显著，说明皮山红羊特征矿物质指纹图谱主要体现在微量元素及稀有元素中。如图1d所示，皮山红羊样本分别聚集于判别函数1的下侧和上侧，而绝大多数湖羊样本则聚集在判别函数1的上侧，且不同品种的样本点无重叠，表明不同品种间可以得到明显的判别效果，且皮山红羊品种判别可能受肌肉部位影响。图1e显示，尽管不同肌肉部位样本点无重叠，但背最长肌中矿物元素组成有显著差异，印证了背最长肌累积的特征矿物元素比半腱肌更独特。

2.3 交叉验证

为验证线性判别模型的准确性和稳定性，需要对模型结果进行交叉验证，验证结果见表2。羊肉的不同品种及不同肌肉部位的判别准确率全部为100.00%，且整体准确率也为100.00%，说明LDA模型稳定性好，基于矿物元素对皮山红羊的鉴别准确有效。

表2 皮山红羊、湖羊背最长肌及半腱肌基于矿物元素的交叉验证判别结果Table 2 Cross-validation results based on mineral elements in semitendinosus and longissimus dorsi muscles of Pishan Hong sheep and Hu sheep

然而，简单的交叉验证会存在过度拟合的风险，从而导致判别误差。同时，实验样本量不同也会对判别准确率造成影响[14]。因此，为了更好地评估判别模型的效果，本研究采用K-折交叉验证（K选择10）对模型进行验证分析。K-折交叉验证是将所有样本随机分成样本数量接近的10 组，以其中9 组构建判别模型，剩余1 组为验证组进行模型准确率检验，步骤重复10 次使每1 组都成为1 次验证组，最终得到10 次验证准确率，然后以平均准确率作为判别模型的最终准确率[15]。

如表3所示，基于具有显著差异的28 种矿物元素（Na、P、K、43Ca、44Ca、Al、Mn、Fe、Zn、Se、Sr、Sn、Tb、Co、Mo、Rh、Pd、Te、Cs、Ba、La、Nd、Dy、Ho、Tm、Hf、Cr和Sb）对不同羊肉样品进行K-折交叉验证后，平均准确率仍为100%，说明特征矿物元素结合化学计量学方法能够有效鉴别皮山红羊不同肌肉，准确率高。通过对不同品种建立判别模型并进行K-折交叉验证，得到准确率为100%，说明尽管皮山红羊和湖羊在相同的饲养环境和条件下，但其肌肉组织对于矿物元素的累积却存在显著差别，因此矿物元素指纹图谱对皮山红羊真伪性鉴别具有十分重要的意义。另外，基于矿物元素对不同肌肉部位建立的判别模型准确率为99.29%，说明矿物元素在不同肌肉部位间也存在显著差异。总体而言，矿物元素是鉴别皮山红羊不同肌肉的理想指标，结果准确稳定，通过进一步筛选确认其特征元素，可以为皮山红羊真实性鉴别提供有效数据。

表3 皮山红羊、湖羊背最长肌及半腱肌基于矿物元素的K-折交叉验证判别结果Table 3 K-fold cross-validation results based on mineral elements in semitendinosus and longissimus dorsi muscles of Pishan Hong sheep and Hu sheep

2.4 PLS-DA

通过对皮山红羊肌肉矿物元素进行LDA及交叉验证，发现矿物元素对于皮山红羊品种鉴定具有良好的效果，因此其特征的矿物元素可以作为鉴别皮山红羊真实性的关键指标。图2a为PLS-DA得分图，成分1和成分2分别解释贡献了总成分的70.1%和5.8%，且皮山红羊的两个肌肉部位与湖羊肌肉在成分1上有明显的区分，表明矿物元素对羊肉品种的区分效果更好；图2b为不同矿物元素在羊肉样本中变量差异贡献度（variable important in projection，VIP）的得分图，若矿物元素的VIP值大于1.00，表明该元素对整体判别模型的贡献度高于平均水平，且VIP值越大，贡献度越高[16]。如图2b所示，共有13 种矿物元素VIP值大于1.00，分别是La、Zn、Cs、Sn、Ho、Fe、Rh、Co、Se、Te、Mo、Al、Sb，大部分是稀有元素。结果表明这13 种元素为区分皮山红羊和湖羊的重要标志性矿物元素，且根据贡献度高低可以发现，羊肉不同品种及不同肌肉间标志矿物元素各有不同，皮山红羊的特征矿物元素为Ho、Rh和Te等微量元素，且这些微量元素在不同肌肉部位中也有明显差异。判别模型的构建为鉴别皮山红羊真实性提供重要的参考意义，且特征元素的确定也为皮山红羊矿物元素指纹图谱的建立提供了重要的理论支持。

图2 基于差异矿物元素的PLS-DAFig.2 PLS-DA plots based on differential mineral elements

3 讨论

生物体在生长过程中，会从周围环境摄取矿物质，主要通过“土壤-饲料-动物组织”的途径在动物体内沉积，所以不同动物品种、不同肌肉部位的矿物质沉积能力以及不同饲养环境都会对其矿物元素组成产生影响[17]。

羊肉肌肉中含量最高的矿物元素为常量元素，通常由饲料供给，并随着动物的生长而沉积于肌肉中[18]。研究发现，尽管皮山红羊和湖羊具有相同的饲养条件，但与湖羊相比，皮山红羊肌肉中仍检测到较高含量的常量元素（Na、P、K、43Ca和44Ca），表明皮山红羊品种具有较强的矿物元素沉积能力，其肌肉组织中灰分物质含量较高，含水量较低[19]，这可能与皮山红羊肌纤维直径更小、肌纤维密度更高有关[20]。Na和K是保持渗透压稳定、调节酸碱平衡的两种关键元素[21]；同时，Ca和P元素含量越高，调节机体细胞功能及调控宰后嫩度的能力越强[22]，从而使皮山红羊具有更好的品质特性和营养功效。另外，通过对比皮山红羊不同肌肉部位的矿物元素组成发现，其背最长肌的矿物元素含量较高，表明背最长肌比半腱肌具有更强的矿物元素沉积能力。不同肌肉部位中矿物元素含量的差异，主要是由于不同类型的肌纤维影响代谢积累差异所致。背最长肌含有较高比例的II型肌纤维，属于糖酵解型肌肉，半腱肌则属于氧化型肌肉，糖酵解型肌肉在反刍动物体内会表现出更强的“双肌现象”，从而沉积更高含量的矿物元素[23]。

与常量元素相比，微量元素虽在动物体内含量较低，但也起到了重要作用。Fe和Zn是两种重要的微量元素，它们在肌肉中的含量范围分别为18.32～20.56 mg/kg和23.06～25.20 mg/kg，且这两种元素在皮山红羊的背最长肌中含量最高，其在红羊与湖羊肌肉中的含量超过了《中国食物成分表》中相应的参考标准（Fe：背最长肌为18.0 mg/kg；Zn：背最长肌为22.2 mg/kg）[24]。Fe能够参与机体血红蛋白与肌红蛋白的合成，所以较高的Fe含量可能与红羊与湖羊生活在高海拔地区，受到高原低氧及低气压环境影响，导致其肌红蛋白含量较高有关[25]。Zn元素对骨骼生长、免疫功能和机体生长等有重要影响，它也是超氧化物歧化酶的重要组成成分，以锌指蛋白的形式与DNA结合，从而发挥生物学作用[26]。

羊肉肌肉中稀有元素组成受当地环境影响较大，具有较强的地区特异性[27]，皮山红羊和湖羊饲养在同一环境中，因此大多数稀有元素并未在不同品种及不同肌肉部位间呈现显著差异。然而，由于品种对矿物元素沉积能力差异的影响，Rh、Dy、Ho、Tm等稀有元素仅在皮山红羊肌肉中检出，因此，这些稀有元素可以作为鉴别及区分红羊的关键元素。在此基础上，本研究构建LDA。结果表明，常量元素和微量元素虽在单因素方差分析及多重比较中具有显著差异，但对皮山红羊品种鉴定贡献度较低，而稀有元素则是鉴定皮山红羊品种和不同肌肉部位的重要标志物，且在相同饲养条件下，动物组织中矿物元素组成仍因品种和肌肉的不同存在代谢累积差异，这种差异在糖酵解型肌肉（背最长肌）中表现得更为明显，因此，开展动物糖酵解型肌肉矿物元素组成的鉴定更具有科学意义。通过交叉验证和K-折交叉验证，判别模型证明有较高的准确率且稳定性好，整体模型的准确率高达100%，对品种和肌肉部位的模型判别准确率也分别达到100%和99.29%，这表明矿物元素结合化学计量学是皮山红羊鉴别的重要手段之一。

矿物元素在不同品种和肌肉部位中存在组成差异，因此特征矿物元素可以作为鉴别皮山红羊的重要标志。其中共有13 种元素在判别皮山红羊中起到了重要作用，为La、Zn、Cs、Sn、Ho、Fe、Rh、Co、Se、Te、Mo、Al和Sb。这些元素大多为稀有元素，且多种研究表明其是鉴别不同品种及不同地区羊肉的重要矿物元素。例如，Sb元素被认为是区分产自内蒙古、重庆和菏泽羊肉的重要元素，且在菏泽羊肉中含量显著高于其他地区羊肉[28]；而Rh元素也可作为区分内蒙古地区不同品种及不同饲养方式羊肉的重要矿物元素[29]。这些特征元素的形成与当地的地理特征相对应，说明矿物元素在肌肉中的累积也会受到当地环境的影响。Rh、Te和Ho元素对判别皮山红羊贡献度较高，且这3 种元素只在皮山红羊肌肉中检测到，可作为标志皮山红羊背最长肌的关键矿物元素。Rh元素作为铂族元素之一，存在于红羊肌肉中可能与新疆当地的干旱气候有关[30]。另外，尽管Te元素的VIP值只有1.10，但其对红羊判别也有贡献作用，且在皮山红羊背最长肌中含量最高。这类重金属在皮山红羊中含量较高的原因可能与当地位处昆盖山成矿亚带，含有以地球化学活动性强的矿化元素有关[31]。虽然Sb属于有害重金属，在皮山红羊背最长肌含量最高，为（1.10±0.08）μg/kg，但其含量远低于欧盟安全标准（100 μg/kg）[14]，说明红羊肉对人体无任何安全危害。综上所述，矿物元素指纹图谱技术对于鉴定皮山红羊真实性准确有效，是未来新疆标志性农产品鉴别及溯源的理想信息指标。

4 结论

本研究通过对新疆皮山地区红羊及湖羊的背最长肌及半腱肌中51 种矿物元素含量进行差异分析、LDA及PLS-DA，确定了矿物元素对皮山红羊真实性鉴定的可行性。13 种稀有元素是鉴定皮山红羊的重要指标，包括La、Zn、Cs、Sn、Ho、Fe、Rh、Co、Se、Te、Mo、Al和Sb，其中，Rh、Te和Ho元素对判别皮山红羊的贡献度最高，仅在红羊肌肉中检出，可以作为鉴别皮山红羊的关键矿物元素标志物。这些元素的累积可能与品种、肌肉代谢、饲养环境等因素有关。皮山红羊矿物元素指纹图谱技术准确率高（100%），可以作为一种有效且稳定的鉴别手段，本研究可为新疆其他标志性动物制品及农产品的鉴定溯源奠定基础。