康复新液对糖尿病难愈合创面中AGEs、RAGE及HIF-1表达水平的影响

徐晶晶, 童世红, 舒国斌, 周瑜, 戴晓燕, 王斌

宁波市北仑区人民医院 1皮肤科, 2造口伤口护理门诊, 3检验科, 4门诊输液室, 5内分泌科(浙江宁波 315800)

糖尿病创面难愈合(糖尿病足)是糖尿病患者的主要并发症之一,具有发生机制复杂、治疗成本高及疗效差等特点,容易引发截肢风险。炎性细胞、细胞因子及修复细胞等多种因素都参与糖尿病创面的愈合过程[1-3]。晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs)是体内部分过剩的葡萄糖与游离氨基结合形成的终末产物[4],主要来源于持续的高血糖。它可以与其受体(receptor for advanced glycation end product, RAGE)相互作用,触发氧化应激,继而引发血管炎症[5]。缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)是氧化应激反应中的重要调节因子,能改善组织缺血、缺氧。创面中HIF-1减少伴随血管内皮生长因子(VEGF)的表达下调,会影响糖尿病足创面的发展[6-7]。多项研究证实,AGEs/RAGE通路和HIF-1都与糖尿病足溃疡的愈合和新血管的生成密切相关[8-10],但在糖尿病创面难愈合中AGEs/RAGE通路和HIF-1之间的关系尚不明确。因此,本研究通过观察糖尿病足患者用药后不同时间创面组织羟脯氨酸含量和AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表达的变化,研究糖尿病难愈合创面中HIF-1α的表达是否与AGEs/RAGE通路相关;通过AGE抑制剂吡哆胺干预人皮肤微血管内皮细胞(human dermal microvascular endothelial cells, HMVECs),初步探讨糖尿病难愈合创面中AGEs/RAGE通路与HIF-1是否有关,为临床精准治疗糖尿病难愈合创面提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年1—12月宁波市北仑区人民医院收治的10例糖尿病足患者,年龄40～70岁,均符合《中国2型糖尿病防治指南(2017版)》[11]西医诊断标准。入组前均在内分泌科接受血糖控制,治疗期间监测血糖,达到血糖控制目标(血糖控制目标,空腹≤7.0 mmol/L,餐后2 h≤10.0 mmol/L),糖尿病足分级按照Wagner分级,其中1级2例,2级8例,8例患者均给予哌拉西林他唑巴坦钠针 4.5 g 静脉滴注 1次/d,抗炎治疗,期间炎症指标控制达标,相关数据见表1。本研究方案经宁波市北仑区人民医院伦理委员会审核通过[批件号:2019科审第(22)号],患者及家属知情同意;排除条件:近1个月内服用研究相关药物、创面死腔形成、免疫系统疾病、研究药物过敏、肝肾功能障碍、临床资料不全等。

表1 入选患者临床数据

1.2 药品与试剂 HMVECs(上海致备生物科技有限公司,ZB064)、吡哆胺(Merck,P9380)、人血清白蛋白(Sigma, SRP6182)、Hyp/Hydroxyproline ELISA Kit (LifeSpan BioSciences,LS-F13017)、BCA蛋白定量试剂盒(Solarbio,pc0020)、AGE抗体(Abcam,ab176173)、RAGE抗体(Affinity,DF6405)、HIF-1α抗体(Affinity,DF6405)、β-actin抗体(Affinity,AF7018)。

1.3 主要仪器 酶标仪(MD,CMaxPlus)、低温高速离心机(美国Thermo,Micro17R)、正置光学显微镜(日本尼康,E100)、化学发光仪(上海勤翔,610020-9Q)。

1.4 治疗方法及创面难愈的判定 参考《糖尿病足介入综合诊治临床指南(第五版)》[12]治疗所有患者,积极处理创面,对肉眼可见的感染坏死组织及无活力组织进行彻底清创,直至暴露健康、渗血的软组织,用碘伏消毒后,根据创面大小外用适量康复新液(国药准字z51021834;四川好医生攀西制药有限公司)湿敷并包扎,1次/d,连用4周。在用药0、7、14、28 d观察患者创面渗出物、肉芽组织及上皮生长情况,对治疗效果进行评估[13]并计算治疗有效率。无效:创面缩小< 25%,且肉芽生长很少,临床症状无改善;好转:创面缩小≥25%,但<75%,肉芽组织较新鲜,临床症状改善;显效:创面缩小≥75%,肉芽组织新鲜,临床症状缓解;痊愈:创面上皮完全覆盖,质地坚实,临床症状、体征基本消失。有效率(%)=(n痊愈+n显效+n好转) /n总×100%。

1.5 ELISA检测患者创面肉芽组织中羟脯氨酸的水平的变化 在外用药0、7、14、28 d时先后用生理盐水棉球和干棉球轻拭创面,再用眼科剪从创面中央区域取一块肉芽(深度以创面出血为度,大小约0.3 cm×0.3 cm),存放在-80 ℃冰箱备用。如果创面已经愈合,则不再取材进行测试。取出样本恢复至室温,加PBS制成匀浆,以2 000～3 000 r/min的速度离心20 min,严格按照ELISA试剂盒说明书的方法步骤,检测上清液中羟脯氨酸的含量。

1.6 高级糖酵化终产物人血清白蛋白的制备(AGE-HSA) 在无菌条件下,将人血清白蛋白(human serum albumin, HAS, 300 μmol/L)与葡萄糖(165 mmol/L)在含有200 μmol/L吡多胺或不含吡哆胺的磷酸盐缓冲液(pH=7.4)孵育。加入叠氮化钠(0.02%),以避免微生物污染。样品在37℃下孵育28 d,用无菌的磷酸盐缓冲液透析24 h,以去除溶液中游离的葡萄糖。制备的AGE-HAS和吡多胺+AGE-HSA储存在-20℃处备用。

1.7 HMVECs培养及分组 HMVECs常规复苏培养,待细胞长至90%融合后,无血清培养基饥饿2 h,然后按实验分组进行给药,即对照组、AGE-HSA组、吡多胺+AGE-HAS组。具体给药如下:对照组:用含10%胎牛血清的DMEM正常培养;AGE-HSA组:用220 nmol/L的AGE-HSA处理HMVECs细胞,其他培养条件同对照组;吡多胺+AGE-HSA组:用220 nmol/L的吡多胺+AGE-HSA处理HMVECs细胞,其他培养条件同对照组。

1.8 Western blot检测患者创面和HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表达水平 用干净的剪刀在冰上把创面组织剪碎,取100 mg与1 mL冷Lysis Buffer制成匀浆,冰上静置裂解 15～30 min(提取细胞蛋白样本时,加入RIPA裂解液冰上裂解30 min),4 ℃条件以12 000 r/min的速度离心5 min,BCA法测上清液蛋白浓度。样本蛋白经变性、电泳、转膜、封闭后,分别加入AGEs、RAGE、HIF-1α和β-actin抗体4 ℃孵育过夜,次日加入二抗室温下孵育1 h,ECL化学发光仪显影。利用Image J软件对蛋白灰度值定量分析。

1.9 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析,所有数据以均值±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 给药后不同时间点创面愈合情况的变化 患者在用药后7、14、28 d,随着用药时间的增加,创面愈合情况逐渐改善,药物治疗有效率也呈逐渐升高趋势。见表2。

表2 给药后不同时间点患者创面愈合情况 例

2.2 给药后不同时间点肉芽组织中羟脯氨酸水平的变化 与0 d比较,7、14、28 d患者肉芽组织中羟脯氨酸水平均显著升高(P<0.01),且肉芽组织中羟脯氨酸水平28 d>14 d>7 d>0 d。见表3。

表3 不同时间患者肉芽组织中羟脯氨酸水平的变化

2.3 不同时间点创面组织中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表达水平的变化 与0 d比较,用药后7、14、28 d的创面组织中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表达水平均显著降低(P<0.05,P<0.01)。其中用药后28 d的创面组织中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表达水平最低(P<0.01)。见表4和图1。

图1 不同时间点创面组织中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表达

表4 不同时间创面组织中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表达水平的变化(n=10)

2.4 HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表达水平的变化 与对照组比较,AGE-HSA组的HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表达均显著上调(P<0.01);与AGE-HSA组比较,吡多胺+AGE-HSA组HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表达水平均明显下调,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。见表5和图2。

注:A:对照组;B:AGE-HAS组;C:吡多胺+AGE-HAS组图2 HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表达

表5 HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表达水平的变化(n=10)

3 讨论

糖尿病难愈合创面是糖尿病最具挑战性的并发症之一,致残、致死率及治疗费用都比较高,是国家医疗健康的一项重大挑战[14]。尽管已有大量学者开展糖尿病创面愈合机制的研究,主要方向有信号通路、血管生成、糖基化终末产物等[15-16],但其具体机制仍不明确。本研究通过观察糖尿病患者外用康复新液0、7、14、28 d时创面的愈合情况,同时检测不同用药时间后其肉芽组织中羟脯氨酸的含量变化及AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表达情况,发现随着用药时间的增加,药物有效率28 d>14 d>7 d>0 d,创面肉芽组织中羟脯氨酸的含量28 d>14 d>7 d>0 d,创面AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表达水平0 d>7 d>14 d>28 d;与0 d比较,7、14、28 d的肉芽组织羟脯氨酸含量均显著升高(P<0.01),7、14、28 d组的AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白表达均显著降低(P<0.01)。这表明创面中AGEs、RAGE、HIF-1α的表达水平和糖尿病难愈合创面的预后密切相关。

HIF-1α是HIF-1的一个亚基,对氧浓度敏感[17]。当脂肪组织形成低氧环境后,机体更容易分泌炎症因子,引起HIF-1α升高,继而促进VEGF 的表达,诱导血管生成[18]。动物研究结果显示,上调HIF-1α表达,促进血管生成,能够加快糖尿病大鼠模型的伤口愈合[19-20]。为了进一步探究AGEs/RAGE信号通路和HIF-1在糖尿病难愈合创面中的关系,本研究采用体外培养HMVECs,通过AGE抑制剂吡多胺预处理HMVECs。吡哆胺是AGEs的强抑制剂[21],可以通过俘获低分子量的活性羰基前体,抑制糖基化中间产物转变形成AGEs[22]。研究结果显示,与对照组比较,AGE能显著上调HMVECs中AGEs、RAGE、HIF-1α蛋白的表达(P<0.01),而吡多胺能显著抑制这种上调作用(P<0.01)。这表明HMVECs中HIF-1α的表达可能与AGEs/RAGE信号通路的活化密切相关。

综上所述,糖尿病难愈合创面的预后与其AGEs、RAGE、HIF-1α的表达水平密切相关,其中HIF-1α的表达可能与AGEs/RAGE信号通路的活化有关,这为临床治疗糖尿病难愈合创面提供新的思路和方向。但是现阶段的研究尚不够深入,样本量较少,细胞实验中未验证康复新液的作用,未开展动物实验进行验证,AGEs/RAGE信号通路与HIF-1之间具体的调控机制仍不明确,我们将在今后的研究中进一步探讨。

利益相关声明:所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献说明:徐晶晶负责实验设计、开展、论文撰写;童世红、舒国斌参与实验的开展;周瑜、戴晓燕负责数据收集、分析;王斌负责实验指导、论文修改。全体作者都阅读并同意最终的论文。